Soutenance de thèse de MAIGNET-MAGARD Colette
Titre de thèse
Diversité structurale et catalytique de la Pyruvate:Ferrédoxine oxydoréductase : Réversibilité catalytique et étude comparative de cinq PFOR bactériennes représentatives
Structural and catalytic diversity of pyruvate:ferredoxin oxidoreductase: catalytic reversibility and comparative study of five representative bacterial PFORs.
Résumé de la thèse
La Pyruvate:Ferrédoxine oxydoréductase (PFOR) est une enzyme dépendante de la thiamine pyrophosphate (TPP) jouant un rôle clé dans le métabolisme de nombreuses bactéries et archées anaérobies, ainsi que chez certains eucaryotes. Selon le contexte métabolique, elle catalyse la décarboxylation oxydative du pyruvate en acétyl-CoA et CO2, ou sa synthèse réductrice. Cette famille d'enzymes présente une remarquable diversité structurale et fonctionnelle. La majorité des travaux publiés se sont concentrés sur la réaction de décarboxylation tandis que la synthèse du pyruvate reste très peu documentée.
Ce travail de thèse avait pour objectifs d'établir, via une analyse bibliographique approfondie, une synthèse de la diversité structurale et fonctionnelle des PFOR, et de caractériser expérimentalement un panel de PFOR bactériennes représentatives (Escherichia coli, Desulfocurvibacter africanus, Solidesulfovibrio fructosivorans, Helicobacter pylori et Dehalococcoides mccartyi), sélectionnées pour leur diversité phylogénétique, structurale, de partenaires rédox, de tolérance à l'oxygène et de sens de fonctionnement in vivo. L'effet inhibiteur sur la PFOR de composés développés contre la pyruvate déshydrogénase (PDH), une autre enzyme à TPP, a également été testé.
L'analyse bibliographique a révélé un cœur catalytique conservé chez toutes les PFOR, associé à une grande plasticité structurale (une à cinq sous-unités, jusqu'à sept domaines) et fonctionnelle, reflétant une adaptation à des environnements métaboliques variés. Les cinq PFOR ont été produites dans E. coli et purifiées sous forme active et stable, dont deux non décrites à ce jour. Le pH optimal et les paramètres cinétiques de la décarboxylation du pyruvate ont été déterminés pour certaines d'entre elles, confirmant une affinité apparente systématiquement plus élevée pour le CoA que pour le pyruvate, caractéristique commune à toutes les PFOR connues. Le module PFOR de D. mccartyi, prédit comme associé à un complexe bifurquant/confurquant les électrons, a été purifié et caractérisé pour la première fois, révélant une activité d'oxydation du pyruvate. Enfin, des phosphonates analogues du pyruvate, actifs sur la PDH, n'ont montré aucun effet inhibiteur sur la PFOR.
Thesis resume
Pyruvate:Ferredoxin oxidoreductase (PFOR) is a thiamine pyrophosphate (TPP)-dependent enzyme playing a key role in the metabolism of numerous anaerobic bacteria and archaea, as well as in some eukaryotes. Depending on the metabolic context, it catalyzes the oxidative decarboxylation of pyruvate into acetyl-CoA and CO2, or its reductive synthesis. This enzyme family displays remarkable structural and functional diversity. Most published studies have focused on the decarboxylation reaction, while pyruvate synthesis remains very poorly documented.
This thesis aimed to establish, through an in-depth literature analysis, a synthesis of the structural and functional diversity of PFORs, and to experimentally characterize a panel of representative bacterial PFORs (Escherichia coli, Desulfocurvibacter africanus, Solidesulfovibrio fructosivorans, Helicobacter pylori, and Dehalococcoides mccartyi), selected for their phylogenetic, structural, redox partner, oxygen tolerance, and in vivo directionality diversity. The inhibitory effect on PFOR of compounds developed against pyruvate dehydrogenase (PDH), another TPP-dependent enzyme, was also tested.
The literature analysis revealed a conserved catalytic core across all PFORs, associated with substantial structural plasticity (one to five subunits, up to seven domains) and functional diversity, reflecting adaptation to varied metabolic environments. All five PFORs were produced in E. coli and purified in active, stable form, two of which had not been previously described. The optimal pH and kinetic parameters of pyruvate decarboxylation were determined for some of them, confirming a systematically higher apparent affinity for CoA than for pyruvate, a feature common to all PFORs characterized to date. The PFOR module of D. mccartyi, predicted to be associated with an electron-bifurcating/confurcating complex, was purified and characterized for the first time, showing pyruvate oxidation activity. Finally, phosphonate compounds, that are analogs of pyruvate and active against PDH, showed no inhibitory effect on PFOR.