Soutenance de thèse de Gabriel BRISOU

Le lymphome folliculaire (FL) est une hémopathie lymphoïde dérivant des cellules B du centre germinatif (GC). Grâce à un modèle murin mimant l’apparition sporadique de l’anomalie prototypique du FL, la translocation BCL2/IGH, nos travaux antérieurs ont démontré que la genèse du FL est un processus dynamique nécessitant l’entrée itérative de cellules B mémoires BCL2+ dans le GC afin de s’y accumuler et progresser vers des stades pré-néoplasiques. Par ailleurs, en nous appuyant sur une analyse transcriptomique de cellules uniques issues de FL humains, nous avons mis en évidence que celles-ci ne sont pas ‘bloquées’ à un stade particulier du GC, mais présentent une désynchronisation du programme d'expression spécifique du GC. Au côté de la translocation BCL2/IGH, des mutations perte de fonction du régulateur épigénétique KMT2D, une histone H3K4 methyltransferase, sont également retrouvées dans environ 90% des FL. La façon dont les deux évènements génétiques les plus fréquents chez l’homme coopèrent pour perturber la dynamique fonctionnelle du GC reste un champ inexploré. Afin d’étudier les conséquences in vivo de l'inactivation de Kmt2d et de la surexpression de BCL2 dans la régulation de la dynamique GC/mémoire, nous avons développé un modèle murin qui combine la délétion conditionnelle de Kmt2d au cours du développement B et l’expression constitutive de BCL2. Seules les souris double-mutantes Kmt2d-/- BCL2+ développent des lymphomes B issues du GC, récapitulant les caractéristiques histologiques et phénotypiques associées à la progression du FL chez l’homme, des stades pré-néoplasiques au stade de tumeur avérée. Pour cette thèse, nous avons mis en œuvre une approche intégrative sur cellule unique combinant l’analyse phénotypique, transcriptomique et la clonalité du récepteur B afin de caractériser l'hétérogénéité de cellules B GC et mémoires dans des conditions d'immunisation aigue ou chronique. Dans les cellules GC sauvages (WT), nous avons identifié une hétérogénéité fonctionnelle caractérisée par un continuum d’états polarisés par la zone sombre et la zone claire reflétant le cycle physiologique du GC et définissant ainsi l’identité de la dynamique transcriptionnelle du GC. Lors de réponses aigues, les cellules GC de tous les génotypes ségrégent ensemble suggérant que les altérations de BCL2 ou Kmt2d ne perturbent pas la dynamique du GC lors de la première rencontre avec l’antigène. En revanche, les cellules uniques issues de lésions pré-néoplasiques ou de tumeurs murines Kmt2d-/- BCL2+ s’accumulent dans des états frontières GC/mémoires où la synchronisation des clusters de co-expression spécifiques du GC normal sont progressivement perdus. Comme dans le FL humain, nous montrons que les lymphomes Kmt2d déficients ne sont pas ‘bloqués’ à un stade particulier du GC mais ont adopté une dynamique fonctionnelle propre associée à la progression maligne. Au vu du rôle prépondérant du microenvironnement dans la pathogénèse du FL, nous avons exploré si ces altérations intrinsèques à la tumeur étaient associées à un changement de phénotype des cellules immunes du GC pouvant ainsi contribuer à la perte de synchronisation. Nous montrons que l'inactivation de Kmt2d instruit un remodelage du microenvironnement tumoral incluant un recrutement accru de cellules T Helper folliculaires (TFH) présentant une signature d’activation distincte de TFH du GC normal et l’expansion concomitante de cellules T CD8 exprimant des marqueurs d’anergie. En résumé, notre analyse intégrative sur cellules uniques de lymphomes B murins ‘FL-like’ révèle que les mutations de Kmt2d dans les cellules B ont non seulement un rôle intrinsèque favorisant l’expansion de cellules ayant perdu la synchronisation du programme GC, mais aussi un rôle dans le remodelage du microenvironnement immunitaire soutenant la tumeur. Nous établissons donc pour la première fois un lien clé entre le régulateur épigénétique le plus fréquemment muté et le microenvironnement du FL.

Follicular lymphoma (FL) is a prototypical example of germinal center (GC) derived B-cell lymphoma. Using a mouse model recapitulating the sporadic occurrence of the FL hallmark BCL2/IGH translocation in healthy individuals, our previous work demonstrated that FL genesis is a highly dynamic process that requires multiple re-entries of BCL2+ memory B-cells into the GC to ultimately accumulate in lymphoid organs. In line with this, using single-cell gene expression analysis of human FL vs normal GC B-cells, we further discovered that FL cells are not ‘frozen’ at a particular stage of the GC reaction but instead exhibit a major desynchronization of the GC-specific expression program. Besides BCL2 translocations, recurrent loss-of-function mutations in KMT2D, a histone H3 lysine 4 methyltransferase (aka MLL2), have emerged as a key player in lymphomagenesis with mutations found in nearly 90% of FL patients. It remains however unclear to what extend KMT2D mutations and BCL2 translocations cooperate to perturb the functional dynamics of the GC we observe in humans. To explore the in vivo consequences of Kmt2d inactivation with BCL2 overexpression in regulating GC/memory dynamics, we developed a mouse model which combines conditional deletion of Kmt2d early during B-cell development and constitutive expression of the BCL2 protein. Only double-mutant Kmt2d-/-BCL2+ mice manifested with GC-derived lymphomas in chronically immunized animals, recapitulating histological and phenotypic features associated with human FL progression from early preneoplastic lesions to overt FL-like tumors thereby confirming that Kmt2d acts as a tumor suppressor gene whose early loss facilitates lymphomagenesis. Here, we investigated the chromatin based-mechanisms leading to progressive lymphoma progression and used integrative single-cell analysis of phenotype, gene expression, and immunoglobulin heavy chain locus clonality to deconvolute the cellular heterogeneity of GC and memory B-cells after acute or chronic T-cell dependent immunization in double-mutant vs single BCL2+, Kmt2d-/- or wild-type (WT) mice. We found that populations of WT GC B-cells were molecularly heterogeneous and spanned a cyclic continuum of transitional B-cell states where synchronized expression of gene modules characterized mouse GC functional identity. In acute responses, single GC B-cells from all genotypes clustered together suggesting an unperturbed GC transcriptional dynamic upon first antigen encounter. However, single preneoplastic and lymphoma B cells accumulated in transitional cell states linked to GC/memory transition where the synchrony of GC-specific co-expression patterns was progressively lost. We conclude that Kmt2d-deficient lymphomas were not blocked at a particular stage of the GC reaction but likely adopted a novel functional dynamic mode associated with the progression to advanced stages of FL. Interestingly, by exploring whether tumor cell-intrinsic factors may affect immune cell phenotypes to support the loss of the GC gene expression synchrony, we uncovered that Kmt2d deficiency instructed a progressive remodeling of the tumor microenvironment with an increased recruitment of CD4+ T-follicular helper (TFH). Furthermore, single-cell RNA-seq revealed a TFH cluster with an activation signature distinct from normal TFH and a concomitant expansion of CD8+ T-cells expressing exhaustion markers. In summary, our integrative single-cell analyses of murine lymphomas revealed that Kmt2d mutations in FL not only instruct B-cell intrinsic effects involving the desynchronization of the normal GC expression program, but also trigger a concomitant re-education of a tumor-supportive niche likely contributing to immune evasion. For the first time, we established a key link between the most frequent epigenetic alteration and the FL microenvironment.