Soutenance de thèse de PANZIRONI Giulia
Titre de thèse
Contribution au développement d'un procédé de biodégradation enzymatique destiné au traitement des antibiotiques des eaux.
Contribution to the development of an enzymatic biodegradation process for the treatment of antibiotics in water.
Résumé de la thèse
La résistance aux antimicrobiens est une menace mondiale croissante, qui devrait causer jusqu'à deux millions de décès d'ici 2050. Elle est alimentée par l'utilisation généralisée et l'accumulation environnementale des antibiotiques. Une stratégie d'atténuation clé est la dégradation de ces polluants issus des eaux usées avant leur rejet dans les écosystèmes. Dans cette thèse, le potentiel des enzymes comme biocatalyseurs pour la bioremédiation des antibiotiques est étudié. Les criblages initiaux utilisant des laccases fongiques libres de diverses origines et degrés de pureté n'ont pas permis d'inactiver significativement les tétracyclines. Pour étendre leur potentiel oxydatif, un criblage systématique de quatre systèmes laccase-médiateur (LMS) a été mené à travers 360 conditions expérimentales. Ces essais ont utilisé la laccase purifiée de Pycnoporus cinnabarinus. Les médiateurs évalués comprenaient l'ABTS, l'HBT, le syringaldéhyde (SAD) et l'acide syringique (SAC). Les dosages enzymatiques, les ratios médiateur/substrat et les temps de réaction ont été systématiquement variés. Une approche haut débit originale a été développée pour suivre l'activité antimicrobienne résiduelle pendant la biotransformation de la doxycycline, choisie comme composé modèle. Une stratégie analytique globale a combiné des tests antimicrobiens, la déconvolution spectroscopique UV-Vis et la chromatographie en phase liquide. Cette approche a permis d'élucider avec succès les mécanismes de réaction sous-jacents. De manière cruciale, les tests antimicrobiens ont révélé que la chimie du médiateur régit la réduction de l'activité résiduelle selon l'ordre ABTS > SAD > HBT > SAC. De plus, des intermédiaires radicaux transitoires augmentent temporairement l'activité antimicrobienne. En revanche, des zones d'atténuation spécifiques apparaissent dans le système médié par le SAD à de faibles concentrations d'enzyme. Cette réduction représente une diminution allant jusqu'à 15 000 fois par rapport aux moyennes de la littérature. Ces résultats mettent en évidence le potentiel biotechnologique des médiateurs biosourcés pour minimiser efficacement la consommation de biocatalyseur. Par ailleurs, l'immobilisation covalente de l'enzyme sur des microparticules de silice permet d'étendre la stabilité opérationnelle sous conditions catalytiques de 3 à 11 jours. Cette amélioration a été obtenue dans une gamme élargie de pH allant de 3,0 à 5,0. Ce biocatalyseur hétérogène a maintenu des performances stables sur 20 cycles consécutifs de dégradation de l'ABTS. Il a conservé jusqu'à 80 % de son efficacité à un pH optimisé de 5,5. Globalement, ce travail établit une plateforme rigoureuse pour l'évaluation des traitements enzymatiques. Il démontre une biotransformation à haute efficacité tout en surmontant les verrous techniques liés à la réutilisabilité et à la stabilité opérationnelle des enzymes.
Thesis resume
Antimicrobial resistance is a growing global threat, projected to cause up to two million deaths by 2050. It is driven by the widespread use and environmental accumulation of antibiotics (ABs). A key mitigation strategy is the degradation of ABs from wastewater before their release into ecosystems. In this thesis, the potential of enzymes as biocatalysts for AB bioremediation is investigated. Initial screenings using free fungal laccases from diverse origins and purification grades failed to achieve meaningful inactivation of tetracyclines under typical conditions. To expand their oxidative potential, a systematic screening of four laccase–mediator systems (LMSs) was conducted across 360 experimental conditions using purified Pycnoporus cinnabarinus. The evaluated mediators included 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), 1-hydroxybenzotriazole (HBT), syringaldehyde (SAD), and syringic acid (SAC), varying enzyme dosages, mediator-to-substrate ratios, and reaction times. An original high-throughput approach was developed to monitor residual antimicrobial activity during the biotransformation of doxycycline (DC), selected as a model compound. A comprehensive analytical strategy combined antimicrobial assays, UV–Vis spectroscopic deconvolution, and liquid chromatography to successfully elucidate the underlying reaction mechanisms. Crucially, antimicrobial tests revealed that mediator chemistry drives bioremediation efficiency in the order ABTS > SAD > HBT > SAC. Moreover, transient radical intermediates temporarily increase antimicrobial activity, while specific mitigation zones appear in the SAD-mediated system at low enzyme concentrations (up to a 15,000-fold reduction compared to literature averages). These findings highlight the biotechnological potential of utilizing bio-based mediators to successfully minimize biocatalyst consumption in bioremediation processes. Covalent enzyme immobilisation onto silica microparticles extend enzyme operational stability under catalytic conditions from 3 to 11 days within broadened pH window (3.0–5.0). This heterogeneous biocatalyst maintained stable performance over 20 consecutive cycles of ABTS degradation, retaining up to 80% of its efficiency at an optimized pH of 5.5. Overall, this work establishes a framework for evaluating enzymatic treatments, demonstrating high-efficiency DC biotransformation while successfully overcoming technical bottlenecks related to enzyme reusability and operational stability.