Soutenance de thèse de LAVIGNOLLE HEGUY Maria del Rosario
Titre de thèse
Epic-SCENITH : une approche combinant métabolisme et épigénomique pour étudier la reprogrammation des cellules myéloïdes, du stress glycolytique au glioblastome humain
Epic-SCENITH: An Approach Combining Metabolism and Epigenomics to Study Myeloid Cell Reprogramming, from Glycolytic Stress to Human Glioblastoma
Résumé de la thèse
Contexte : Le métabolisme cellulaire et le remodelage épigénétique sont deux déterminants des fonctions des cellules immunitaires, influençant l'initiation et la progression des cancers. Ces pro-cessus sont étroitement liés : les métabolites servent de substrats et de cofacteurs aux enzymes responsables des modifications post-traductionnelles des histones, mais leur étude conjointe reste techniquement difficile. Le glioblastome, tumeur cérébrale primitive la plus fréquente et la plus agressive chez l'adulte, constitue un modèle pertinent en raison de la forte hétérogénéité métabolique de son microenvironnement et de son infiltrat immunitaire immunosuppresseur. Ce travail visait à développer une méthode permettant d'étudier simultanément le métabolisme fonctionnel et les modifications des histones, puis à l'appliquer afin d'explorer les interactions entre métabolisme et épigénétique dans les cellules myéloïdes et tumorales, d'abord in vitro puis dans des échantillons humains de glioblastome.
Méthodes : Nous avons développé Epic-SCENITH, combinant SCENITH, un test fonctionnel du mé-tabolisme, et CUT&RUN, une technique épigénomique à haut débit. Un modèle in vitro d'hétérogénéité métabolique a été obtenu en traitant des cellules THP-1 avec une faible dose de 2-désoxy-D-glucose (2-DG) pendant 72 h. Le métabolisme énergétique et les niveaux globaux de H3K4me3, H3K27ac et H3K27me3 ont été évalués par cytométrie. Epic-SCENITH a ensuite été utili-sée pour comparer les profils épigénomiques de cellules THP-1 dépendantes de la glycolyse ou du métabolisme mitochondrial. Enfin, une cohorte de 10 patients atteints de glioblastome et un ab-cès cérébral non tumoral ont été étudiés. Les tissus issus de trois régions tumorales (périphérique, angiogénique et nécrotique) ainsi que le sang périphérique ont été analysés par cytométrie en flux spectrale pour l'immunophénotypage, le métabolisme fonctionnel (SCENITH) et les niveaux globaux de modifications post-traductionnelles des histones, avant l'application d'Epic-SCENITH à des monocytes, des cellules suppressives dérivées de la lignée myéloïde (MDSC) et des cellules souches de glioblastome triés.
Résultats : Epic-SCENITH a permis de retrouver les distributions génomiques attendues et l'enrichissement spécifique des trois marques d'histones. Dans le modèle THP-1, le traitement par le 2-DG a induit un basculement partiel vers une dépendance mitochondriale sans modifier les ni-veaux globaux des modifications post-traductionnelles des histones, mais Epic-SCENITH a révélé un enrichissement différentiel de H3K27ac au niveau du pseudogène AFG3L1P entre cellules dé-pendantes de la glycolyse et du métabolisme mitochondrial. Dans la cohorte de glioblastomes, l'immunophénotypage a identifié les principales populations tumorales et immunitaires. Une classification non supervisée fondée sur l'activité métabolique a séparé les patients en deux groupes indépendamment de la région tumorale, un profil également observé pour H3K27me3 et H3K4me3 ; les MDSC présentaient systématiquement un profil métabolique et épigénétique in-verse des autres populations.
Conclusion : Ce travail présente Epic-SCENITH, une méthode d'analyse intégrée du métabolisme cellulaire et des états épigénétiques. Epic-SCENITH a permis d'identifier AFG3L1P comme un locus présentant des différences épigénétiques entre cellules aux profils métaboliques distincts. L'étude d'une cohorte de glioblastomes a mis en évidence une association entre l'activité translationnelle et la méthylation des histones, tout en montrant que les MDSC possèdent un profil métabolique et épigénétique distinct des autres populations du microenvironnement tumoral. Ces travaux fournissent un nouvel outil expérimental et des arguments en faveur d'un lien fonctionnel entre programmes métaboliques et épigénétiques dans les cellules myéloïdes et tumorales.
Thesis resume
Background: Cellular metabolism and epigenetics remodelling are both drivers of immune cell functions, impacting on cancer onset and progression. Interestingly, both processes are tightly connected: metabolites serve as substrates and cofactors for the enzymes that place and remove histone post-translational modifications, yet studying this crosstalk remains technically challeng-ing. Glioblastoma, is the most common and lethal primary brain tumour in adults, and provides a particularly relevant setting to address this question, as its tumour microenvironment is charac-terized by pronounced metabolic heterogeneity and an immunosuppressive immune infiltrate. This work aimed to develop a method to study functional metabolism and histone modifications simultaneously, and to apply it to elucidate the metabolic-epigenetic interplay in myeloid and tumour cells, first in a controlled in vitro model and then in human glioblastoma samples.
Methods: We developed Epic-SCENITH, a method combining SCENITH, a functional metabolic as-say, with CUT&RUN, a high throughput epigenomic technique.
An in vitro model of metabolic heterogeneity was generated by treating THP-1 cells with a low dose of 2-Deoxy-D-glucose (2-DG), a glycolytic inhibitor, for 72h. Functional energetic metabolism and global profiling of H3K4me3, H3K27ac and H3K27me3 were assessed by cytometry. Epic-SCENITH then was applied to study epigenomic differences between glycolytic and mitochondrial dependent THP-1 cells.
Finally, a cohort of 10 GBM patients and one non-tumoural abscess was studied. Tumour tissue from three regions (peripheral, angiogenic, necrotic) and peripheral blood were characterized by spectral flow cytometry for immunophenotyping, functional metabolism (SCENITH) and global histone post-translational modification levels, before applying Epic-SCENITH to sorted monocytes, myeloid-derived suppressor cells and glioblastoma stem cells.
Results: Epic-SCENITH reliably recovered expected genomic distributions and locus-specific en-richment for all three histone marks. In the THP-1 model, 2-DG treatment induced a partial shift toward mitochondrial dependence without affecting global histone PTM levels, but Epic-SCENITH uncovered differential H3K27ac binding at the pseudogene AFG3L1P between Glycolytic and Mi-tochondrial dependent cells.
In the GBM cohort, immunophenotyping identified the major tumour and immune populations across tumour regions and blood. Unsupervised clustering of metabolic activity segregated pa-tients into two groups independently of tumour region, a pattern mirrored by global H3K27me3 and H3K4me3 levels; MDSCs consistently showed an inverted metabolic and epigenetic pattern relative to other populations.
Conclusion: This work delivers Epic-SCENITH, method for the integrated analysis of cellular me-tabolism and epigenetic states. Epic-SCENITH allowed the identification of AFG3L1P as a locus epi-genetically different between cells harbouring distinct metabolic profiles. Our studies in a small human GBM cohort, uncovered an association between translational activity, histone methyla-tion, and highlighted MDSCs as metabolically and epigenetically distinct from other cell popula-tions within the tumour microenvironment. Altogether, this work provides both a new experi-mental tool and biological evidence supporting a functional link between metabolic and epige-netic programs in myeloid and tumour cells.