Soutenance de thèse de LOPEZ HERNANDEZ Abel
Titre de thèse
Réexamen de l'identité et des fonctions des cellules dendritiques issues de monocytes provenant de progéniteurs granulocytes-monocytes
Revisiting the identity and functions of the dendritic cells derived from monocytes originated from granulocyte-monocyte progenitors
Résumé de la thèse
Les cellules dendritiques (DC) Sirpα+ sont hétérogènes chez la souris et chez l'Homme. Malgré les progrès récents dans leur caractérisation, il reste difficile de déterminer si les DC Sirpα+ CX3CR1+ correspondent aux cDC2B, aux DC3 ou aux cellules dendritiques dérivées des monocytes (moDC). Les moDC ont été initialement définies à partir de monocytes humains différenciés in vitro en présence de GM-CSF et d'IL-4. Cependant, cette définition a été remise en question, notamment parce que les cDC2B peuvent acquérir des marqueurs macrophagiques lors de l'inflammation et que les DC générées dans les cultures au GM-CSF ont été proposées comme correspondant à des cDC2 dérivées des progéniteurs MDP/CDP.
Par ailleurs, une nouvelle population, les DC3, a récemment été décrite. Ces cellules présentent également un phénotype mixte dendritique et monocytique. Plusieurs fonctions autrefois attribuées aux moDC sont désormais associées aux DC3. De plus, l'existence même des moDC in vitro et in vivo a été remise en question. L'absence de critères fiables permettant de les distinguer des populations apparentées a limité l'étude de leurs fonctions.
Pourtant, les moDC peuvent toujours être générées à partir de monocytes humains ou murins cultivés avec GM-CSF et IL-4. Il est donc nécessaire de réévaluer leur développement, leur relation avec les DC3 et leur éventuelle correspondance avec des populations physiologiques. Une définition claire des moDC permettra de mieux comprendre leur rôle dans les immunopathologies et d'optimiser les approches thérapeutiques reposant sur leur transfert adoptif.
Afin de répondre à ces questions, nous avons établi un atlas moléculaire des DC et macrophages murins générés in vitro, fondé sur l'analyse du phénotype et de l'expression génique. Nous avons combiné des modèles murins de traçage cellulaire et différentes méthodes de différenciation in vitro. Les cellules obtenues à partir de cultures totales de moelle osseuse ou de monocytes purifiés ont été comparées dans des conditions favorisant la génération de moDC (GM-CSF + IL-4) ou de cDC (FLT3-L).
Grâce à la lignée Ms4a3-Cre;Ai14;Zbtb46GFP, nous avons identifié les DC comme des cellules CD45+Zbtb46GFP+ et distingué les cellules Ai14+ dérivées de monocytes ou de progéniteurs MDP. Nous montrons que les moDC constituent l'unique population dendritique présente dans les cultures GM-CSF + IL-4 et qu'elles sont distinctes des DC3, probablement apparentées aux cDC2B. Nous avons identifié des signatures transcriptomiques spécifiques à chaque population et validé leur robustesse par la réanalyse de jeux de données publics.
À l'aide de l'algorithme SciGeneX, nous avons également identifié des modules de gènes spécifiques ou partagés entre populations. Enfin, nous montrons que plusieurs populations de moDC apparaissent in vivo lors d'une allergie aux acariens dans les poumons et les ganglions médiastinaux. Parmi elles, les cellules pulmonaires CD36+ Ms4a3;Ai14+ Zbtb46-GFP+ partagent des modules d'expression avec les cDC, les macrophages et les moDC, suggérant qu'elles pourraient représenter l'équivalent in vivo des moDC générées in vitro. Nous montrons également que des monocytes dérivés de GMP ou de MDP peuvent donner naissance à des populations convergentes ou distinctes lors d'une inflammation stérile péritonéale. Ensemble, nos résultats démontrent que le microenvironnement tissulaire façonne profondément les programmes transcriptionnels des cellules dérivées des monocytes et favorise l'acquisition de caractéristiques associées à l'identité ou à la maturation dendritique.
Thesis resume
Sirpα+ DCs are heterogeneous both in mice and humans. Much of the heterogeneity is being resolved in recent times, but it remains elusive whether CX3CR1+ Sirpα+ DCs correspond to cDC2Bs, DC3s, monocyte-derived dendritic cells (moDCs). moDCs were first identified through in vitro differentiation of human monocytes. moDCs were thought to arise in in vitro bone marrow cultures supplemented with GM-CSF alone or in combination with IL-4. This has been challenged in recent times, as cDC2Bs have been reported to upregulate macrophage markers during inflammation and the DCs in GM-CSF cultures have now been proposed correspond to MDP/CDP-derived cDC2s. A novel DC subset termed DC3s, has been recently described. DC3s also display a mixed DC and monocytic phenotype. Therefore, the functions that once used to be attributed to moDCs have now been proposed to be mediated by DC3s. Furthermore, it has been questioned whether moDCs develop in vitro and in vivo. The lack of rigorous strategies to identify moDCs and separate them from other closely related DC types has precluded the in-depth study of their function.
However, moDCs can be still be generated by culturing human monocytes with GM-CSF and IL-4. Moreover, some studies in mice have reported that monocytes can also give rise to moDCs when cultured with GM-CSF and IL-4. Therefore, there is a need to re-visit whether moDCs develop in vitro, how these cells compare to DC3s and whether they resemble any naturally occurring population in vivo. Clearly defining moDCs, both in vitro and in vivo, will allow to better study their function in immunopathologies and help to refine current therapies that rely on the adoptive transfer of in vitro generated moDCs.
To solve these issues, we have established a molecular atlas of in vitro-derived murine DC types and macrophages, through gene expression and phenotypic profiling, by combining fate-mapping and reporter mice with distinct in vitro differentiation methods. We have compared cells generated in total BM cultures versus those arising from purified monocytes, under differentiation conditions reported to yield moDCs (GM-CSF and IL-4) versus cDCs (FLT3-L).
We have harnessed the Ms4a3-Cre;Ai14;Zbtb46GFP mouse strain to unequivocally identify DCs as CD45+ Zbtb46GFP+ cells and separate as Ai14+ those fate-mapped by Ms4a3 and thus derived either from Ly6C+ monocytes (moDCs) or Ly6C+ MDPs (DC3s). We show that moDCs are the only DC type present in GM-CSF and IL-4 cultures and that they are different from DC3s, which are potentially the same DC type as cDC2Bs. We have identified a unique set of genes specific for each cell type. This has enabled us to define specific molecular fingerprints to identify each cell type at the transcriptomic level. We have further validated this strategy by reanalyzing publicly available datasets and successfully assessing cell identity with the transcriptomic signatures we generated. In addition, we have identified gene modules unique to a given cell type or shared across several ones, by utilizing the algorithm SciGeneX to identify co-expressed genes across the whole atlas. This enabled us to analyze our own data with a high degree of granularity. Furthermore, we report that different moDC populations arise in vivo during HDM-allergy in the lungs and MedLNs. From these various populations, lung CD36+ Ms4a3;Ai14+ Zbtb46-GFP+ cells share common gene expression modules with cDCs, macrophages and moDCs, suggesting that they could be the in vivo counterpart of in vitro-derived moDCs. Moreover, we showed that adoptively transferred GMP and MDP-derived monocytes can give rise to convergent and distinct populations of monocyte-derived cells in the peritoneum upon the local induction of sterile inflammation via thioglycolate administration. Collectively, we found that the local tissue microenvironment induces different programs on monocyte-derived cells causing them to upregulate modules associated to cDC identity or maturation.