Soutenance de thèse de BEN HAJ YAHIA Nour
Titre de thèse
Etude et mise en évidence des propriétés antibactériennes des argiles
Study and mechanistic assessment of the antibacterial properties of clays
Résumé de la thèse
La résistance aux antimicrobiens (RAM), associée à 4,71 millions de décès dans le monde en 2021, oblige à reconsidérer les stratégies thérapeutiques pour traiter des infections potentiellement mortelles. Ce défi croissant exige la mise au point d'approches novatrices, dont l'une repose sur l'utilisation de l'argile, un matériau naturel composé de minéraux.
Les métaux bactéricides (Ag, Cu, Zn, fer redox-actif) offrent également une telle voie, en agissant sur des cibles multiples et simultanées, peu propices à l'émergence de résistances, mais sont limités par une libération brutale d'ions, source de cytotoxicité et de fenêtre thérapeutique étroite. L'hypothèse principale de cette thèse est qu'un minéral argileux peut servir d'agent durable, délivrant un effet nécessaire à la fois en dose et en durée, grâce à la capacité d'échange de l'espace interfoliaire des smectites 2:1. La montmorillonite (MMT) y est étudiée comme support fonctionnel et modifiable, à l'interface de la géochimie des argiles et de la microbiologie, dans le cadre d'un partenariat entre le CEREGE (Aix-Marseille Université, CNRS) et Mayoly Pharma orienté vers une application antiseptique potentiellement industrialisable.
Pour identifier les argiles les plus réactives et comprendre les mécanismes sous-jacents, ce travail combine caractérisation physico-chimique et essais microbiologiques sur des souches (Gram-négatives : Escherichia coli et Gram-positives : Bacillus subtilis). Cette approche permet de relier directement les propriétés des argiles à leur activité antibactérienne. Parmi quatorze argiles testées (naturelles brutes et purifiées), c'est une montmorillonite calcique purifiée (Ca-MMT) a été retenue comme matériau de référence. La Ca-MMT se révèle cependant dépourvue d'une activité bactéricide au sens strict, la réduction bactérienne mesurée (∼74% à 24 h) reflète uniquement une adsorption physique, sans la capacité à interrompre durablement la croissance bactérienne.
L'échange cationique transforme ce support en un véritable bactéricide, et le résultat le plus significatif est que le mécanisme est régi par le métal incorporé et sa spéciation, et non par le seul support. Les MMTs dopées au zinc agissent par un relargage contrôlé d'ions Zn2+ (seulement 4 à 6 % de la charge totale en Zn2+ est libérée sur 24 h, avec une efficacité supérieure à 99,6 %), indépendamment du type de paroi cellulaire, illustrant le principe de libération prolongée recherché. Les montmorillonites dopées au cuivre confirment ce régime de relargage, tout en démontrant que la voie de synthèse détermine la spéciation : la formation in situ de brochantite (Na/Cu-MMT) augmente la charge totale de cuivre mais réduit la fraction échangeable et assure une activité prolongée même à faible concentration, là où l'échange direct perd en efficacité. La montmorillonite dopée à l'argent se distingue de celles dopées au cuivre et au zinc ; elle agit principalement par contact direct plutôt que par le relargage d'ions, malgré un diamètre d'inhibition notable Escherichia coli (∼11,8 mm). Elle présente une double spéciation (Ag⁺ soluble et agrégats amorphes nanométriques d'environ 21 nm) dont l'identité chimique reste à confirmer. Enfin, la MMT échangée au fer ferreux en conditions anoxiques révèle un mécanisme redox d'inhibition quasi totale d'Escherichia coli en moins de cinq heures, malgré un relargage de fer négligeable (<0,1 mM). Ce résultat peut s'expliquer par une acidification locale de l'environnement, accroissant la réactivité du Fe2+ interfoliaire, laquelle est amplifiée par la libération synergique de Mn2+. L'ajout de pyrite (1-2 %) semble accélérer encore cet effet antibactérien.
Enfin, ce travail identifie trois modes d'action distincts (relargage des cations bactéricides, cytotoxicité dépendant du contact et voie redox) et dégage les paramètres de conception déterminants (choix du métal, voie d'échange et contrôle de la spéciation) pour élaborer rationnellement de tels matériaux.
Thesis resume
Antimicrobial resistance (AMR), associated with 4.71 million deaths worldwide in 2021, forces a reconsideration of therapeutic strategies to address the growing inability to treat potentially deadly infections. This increasing challenge requires the development of innovative approaches, one of which relies on the use of clay, a natural fine-grain material composed of minerals such as montmorillonites.
Bactericidal metals (Ag, Cu, Zn, redox-active Fe) also offer such a pathway, acting on multiple and simultaneous targets, which makes resistance less likely to develop. However, their main limitation remains the abrupt release of ions, which can cause cytotoxicity and narrow the therapeutic window. The main hypothesis of this thesis is that a clay mineral can serve as a durable agent, providing the necessary effect both in dose and duration, which free ions cannot ensure, thanks to the exchange capacity of the interlayer space of 2:1 smectites. Montmorillonite (MMT) is studied as a functional and modifiable support, at the interface of clay geochemistry and microbiology, within a partnership between CEREGE (Aix-Marseille University, CNRS) and Mayoly Pharma, aimed at a potentially antiseptic application.
To identify the most reactive clays and understand the underlying mechanisms, this work combines physicochemical characterization and microbiological testing on strains with different envelopes (Gram-negative: Escherichia coli and Gram-positive: Bacillus subtilis). This approach directly links the properties of the clays to their antibacterial activity. Among fourteen tested clays (raw and purified natural samples), a purified calcium montmorillonite (Ca-MMT) emerged as the reference material. However, Ca-MMT lacks strict bactericidal activity; the observed reduction (~74% at 24 hours) reflects only physical adsorption, without the capacity to sustainably interrupt bacterial growth.
Cation exchange transforms this support into a true bactericide, and the most significant result is that the mechanism is governed by the incorporated metal and its speciation, not by the support alone. Zinc-doped MMTs act through controlled release of Zn²⁺ ions (only 4 to 6% of the total charge is released over 24 hours, with over 99.6% efficiency), regardless of cell wall type, illustrating the desired prolonged release principle. Copper-doped montmorillonites confirm this release pattern, while demonstrating that the synthesis method determines the speciation: in situ formation of brochantite (Na/Cu-MMT) increases the total charge but reduces the exchangeable fraction and ensures prolonged activity even at low concentrations, where direct exchange becomes less effective. Silver-doped montmorillonite differs from those doped with copper and zinc; it primarily acts through direct contact rather than ion release, despite a notable inhibition zone against Escherichia coli (~11.8 mm). It exhibits dual speciation (soluble Ag⁺ and amorphous nanometric aggregates around 21 nm), whose chemical identity remains to be confirmed. Finally, Fe(II)-exchanged MMT under anoxic conditions reveals a redox mechanism: nearly total inhibition of Escherichia coli in less than five hours, despite negligible iron release (<0.1 mM). This may be explained by local acidification of the environment, increasing the reactivity of interlayer Fe²⁺, which is amplified by the synergistic release of Mn²⁺. The addition of pyrite (1-2%) appears to further accelerate this antibacterial effect.
Ultimately, this work identifies three distinct modes of action (release of bactericidal cations, contact-dependent cytotoxicity, and redox pathway) and highlights key design parameters (metal choice, exchange pathway, and speciation control) for rationally developing such materials.