Soutenance de thèse de VILLANUEVA Lorenzo
Titre de thèse
Mécanismes biophysiques de formation d'attache par force atomique à grande vitessemicroscopie
Biophysical mechanisms of tether formation by high-speed atomic forcemicroscopy
Résumé de la thèse
<p>La microscopie à force atomique (AFM) est devenue un outil indispensable pour l'étude des systèmes biologiques à l'échelle micro- à nanométrique, principalement par l'imagerie et la spectroscopie de force. Bien que l'AFM à haute vitesse (HS-AFM) ait considérablement amélioré la résolution temporelle en imagerie, son application à la spectroscopie de force sur cellules vivantes reste limitée par des contraintes matérielles, des algorithmes de contrôle lents et une course restreinte des actionneurs piézoélectriques. Cette thèse présente le développement et la mise en œuvre d'une plateforme de microscopie de force à haute vitesse conçue pour surmonter ces limitations, en intégrant une platine à longue portée en z et une architecture de contrôle basée sur FPGA.</p>
<ul>
<li>Le logiciel de contrôle repose sur un système d'acquisition et de traitement des données basé sur FPGA, associé à une interface graphique (GUI) personnalisée. Nous introduisons des algorithmes d'engagement de la sonde fondés sur la prédiction, exploitant les contacts précédemment mesurés entre la sonde et l'échantillon afin d'accélérer l'approche de la sonde jusqu'à des vitesses de l'ordre du mm/s, puis de la décélérer à proximité du contact jusqu'à des vitesses définies par l'utilisateur, de l'ordre du µm/s. Cette stratégie réduit significativement le temps d'acquisition des courbes de force sur de grandes amplitudes ainsi que la densité de données générées. </li>
<li>À l'aide de ce système, nous avons acquis des cartes de force de clusters de cellules tumorales circulantes CTC-44 afin d'en extraire la topographie et les paramètres viscoélastiques. </li>
<li>Pour démontrer davantage la polyvalence de la plateforme, nous avons également mesuré les forces nécessaires à l'extraction de nanotubes membranaires (membrane tethers) à partir de cellules monocytaires, en utilisant des micro-leviers ultra-courts fonctionnalisés avec des molécules d'adhésion. </li>
<li>Notre système permet d'atteindre des vitesses de rétraction allant jusqu'à 6000 µm/s, ouvrant la voie à l'étude de la dynamique des nanotubes membranaires à des vitesses physiologiquement pertinentes. </li>
</ul>
<p>La polyvalence de la plateforme a ainsi été validée à travers deux applications biologiques distinctes. Premièrement, nous avons réalisé une cartographie mécanique rapide de clusters CTC-44, permettant d'extraire avec succès la topographie et les paramètres viscoélastiques de ces échantillons hétérogènes. Deuxièmement, nous avons utilisé des micro-leviers ultra-courts pour sonder la dynamique des nanotubes membranaires dans des cellules monocytaires. </p>
<p>Nos résultats démontrent que le couplage d'une grande amplitude de déplacement en z avec des algorithmes de contrôle à haute vitesse permet une caractérisation mécanique quantitative et à haut débit de systèmes biologiques complexes présentant d'importantes variations topographiques. </p>
<p><strong>Mots-clés :</strong> Microscopie à force atomique à haute vitesse, mécanismes biophysiques, algorithmes d'automatisation du contrôle, formations de liens, FPGA, développement logiciel. </p>
Thesis resume
p>Atomic Force Microscopy (AFM) has become an indispensable tool for probing biological systems at the micro- to nanometer scale, primarily through imaging and force spectroscopy. While high-speed AFM (HS-AFM) has significantly advanced imaging temporal resolution, its application to force spectroscopy on living cells remains limited by hardware constraints, slow control algorithms, and restricted piezoelectric ranges. This thesis presents the development and implementation of a high-speed force microscopy platform designed to overcome these bottlenecks by integrating a long-range z-sample stage with an FPGA-based control architecture.</p>
<ul>
<li>The control software is built upon an FPGA-based data acquisition and processing system along with a custom GUI. We introduce prediction-based probe-engagement algorithms that leverage previously measured probe-sample contact to accelerate probe engagement to mm/s and decelerate it near contact to user-defined μm/s velocities, significantly reducing long-range force-curve acquisition time and data density.</li>
<li>Using this system, we acquired force maps of circulating tumoral cells CTC-44 clusters to extract topography and viscoelastic parameters.</li>
<li>To further explore the versatility of our system, we probed the forces required to extract membrane tethers from monocytic cells using ultrashort cantilevers functionalized with adhesion molecules.</li>
<li>Our system allowed us to cover retract velocities from 100 nm/s up to 6000 μm/s and to explore tether dynamics at physiologically relevant velocities.</li>
</ul>
<p>Our results show that coupling extended z-displacement with high-speed control algorithms enables quantitative, high-throughput mechanical characterization of complex biological systems with large topographical variations, accessing so far unexplored temporal regimes of biological systems.</p>
<p><strong>Keywords:</strong> High-speed atomic force microscopy, biophysical mechanisms, control automation algorithms, tether formation, FPGA, software development.