Soutenance de thèse de SENTHIL KUMAR Charitra Sree
Titre de thèse
imagerie de molécules uniques résolue en polarisation et en anisotropie, pour l'étude de l'architecture de l'actine et de la dynamique du récepteur des cellules T
polarization-resolved single molecule and anisotropy imaging of actin architecture and T cell receptor dynamics
Résumé de la thèse
La microscopie de localisation de molécules uniques (Single-Molecule Localization Microscopy, SMLM) a transformé l'imagerie biologique nanométrique en atteignant des résolutions de l'ordre de l'ångström. Cependant, la microscopie électronique reste la référence pour dévoiler les orientations réelles des structures, au prix d'une préparation d'échantillons lourde qui élimine de nombreux composants cellulaires et peut masquer des informations cruciales sur la dynamique et l'arrangement des biomolécules. L'accès en cellule vivante à l'orientation moléculaire est ainsi essentiel pour comprendre les processus de signalisation. La microscopie d'orientation et de localisation de molécules uniques (Single Molecule Orientation and Localization Microscopy, SMOLM) permet de déterminer simultanément la position et l'orientation de molécules fluorescentes, encodées dans leur fonction d'étalement du point (PSF). Les approches actuelles de PSF modulée nécessitent souvent des dispositifs complexes, agrandissent la PSF et requièrent des analyses computationnelles lourdes, limitant leur usage en environnements biologiques denses.
Cette thèse présente 4Polar3D, une extension de la technique 4Polar2D permettant la récupération complète de l'orientation tridimensionnelle. La méthode repose sur un filtre d'intensité simple au plan focal arrière pour distinguer les inclinaisons hors-plan, garantissant une estimation robuste de l'orientation 3D avec un impact minimal sur la PSF. 4Polar3D permet l'imagerie d'architectures d'actine tridimensionnelles dans des environnements cellulaires complexes, notamment les lamellipodes de cellules tumorales, les podosomes 3D de macrophages et le cytosquelette des lymphocytes T sur substrats activants et non activants.
En outre, la combinaison de 4Polar3D avec une excitation polarisée contrôlée permet de quantifier la mobilité rotationnelle de fluorophores individuels, étroitement liée à leur nature et à leur environnement. Enfin, j'explore l'organisation de l'actine au sein des complexes de signalisation précoces formés lors de l'activation des lymphocytes T dans des synapses immunologiques physiologiques. Des mesures d'anisotropie de fluorescence permettent d'évaluer la dynamique rotationnelle et le compactage moléculaire, notamment via la détection potentielle d'homoFRET dans les complexes TCR–CD3 activés.
Thesis resume
Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM) has revolutionized nanoscale biological imaging with imaging resolutions reaching Angstrom scales. However, electron microscopy remains unparalleled for its ability to reveal true orientations in the sample, at the cost of tedious sample preparation, involving clearing out most cellular contents. This could lead to missing key information of the dynamics of intracellular processes that rely on both spatial arrangement and orientation of biomolecules with each other. Hence, live cell access to molecular orientation is crucial for understanding signaling processes. Single Molecule Orientation and Localization Microscopy (SMOLM) addresses this by determining both the position and orientation of fluorescent molecules, which are intrinsically encoded in their point spread function (PSF). PSF engineering and fitting techniques have been developed to extract this information, but they often involve complex setups, an enlarged PSF size and computationally intensive analyses, limiting their applicability in dense biological environments.
Building on the previously developed 4Polar2D technique which retrieves 2D orientation and wobbling of fluorescent molecules through ratiometric analysis across four polarization channels with minimal PSF deformation, this thesis presents 4Polar3D, an extended approach that recovers full 3D molecular orientation. The method introduces a simple back focal plane intensity filter to distinguish off-plane tilt angles, enabling robust 3D orientation retrieval with minimal effects on PSF size or shape. Using 4Polar3D, I image 3D actin architectures in dense cellular systems, including lamellipodia in tumor cells, 3D podosomes in macrophages, and the T-cell cytoskeleton on non-activating and activating planar substrates.
Beyond orientation imaging, I exploit the combination of 4Polar3D with controlled excitation polarization to quantify molecular rotational mobility at the single-molecule level, which is highly dependent on the fluorophore's nature and environment. Finally, I investigate the ensemble actin organization at early signaling complexes formed after T-cell activation at physiological immunological synapses. Through fluorescence anisotropy measurements, I probe the rotational dynamics and molecular packing by assessing potential homoFRET within activated TCR-CD3 complexes.