Soutenance de thèse de BUTLER-HALLISSEY Ciaran
Titre de thèse
Le rôle du renouvellement des microtubules dans le développement des neurones
The roles of microtubule turnover in developing neurons
Résumé de la thèse
Les microtubules forment un réseau polaire et hautement dynamique qui s'étend dans
tout le cytoplasme des cellules eucaryotes. Composés de dimères de tubuline
polymérisés, les microtubules créent des autoroutes moléculaires pour transporter les
molécules dans la cellule tout en jouant un rôle clé dans la migration, la division et la
définition de la morphologie des cellules. Si une grande partie des microtubules sont
renouvelés par la croissance et l'effondrement dans un processus appelé instabilité
dynamique, certains restent stables. Récemment, il a été démontré que la tubuline
s'intègre dans le réseau des microtubules au niveau des défauts structurels. Il a été
démontré que cette incorporation dans le réseau fournit un mode supplémentaire de
renouvellement des microtubules qui complète l'instabilité dynamique. Pour vérifier
cette observation dans les cellules, nous avons micro-injecté de la tubuline marquée
dans des cellules épithéliales et avons constaté une intégration dans le réseau le long
des microtubules à l'aide d'un microscope à fluorescence à super-résolution. Les
microtubules étant la colonne vertébrale de la morphogenèse neuronale et stimulant le
développement des dendrites et des axones, nous avons voulu explorer l'occurrence de
l'intégration dans le réseau dans les neurones en développement. Nous avons micro-
injecté de la tubuline marquée dans des neurones primaires de l'hippocampe de rat
avant le processus d'émergence des axones. Nous avons associé cette technique à la
microscopie à expansion afin de mieux identifier les microtubules individuels dans les
régions où ils sont densément regroupés. L'intégration s'est produite de manière
préférentielle sur les microtubules périphériques dynamiques non acétylés ; cependant,
elle a également été observée dans les faisceaux centraux plus profonds de
microtubules acétylés stables. Des recherches plus approfondies ont démontré que les
microtubules dans l'axone émergent se stabilisent progressivement au fur et à mesure
du développement du neurone. À l'aide de l'hMB11, un anticorps utilisé pour détecter la
conformation GTP de la tubuline, nous avons constaté une augmentation évidente du
marquage hMB11 dans l'axone émergent. Ce phénomène s'est produit parallèlement au
stade de stabilisation de l'axone observé dans les neurones micro-injectés. De plus, la
distribution de l'hMB11 s'est avérée sensible aux changements de la tubuline acétylée au
cours du développement. Dans l'ensemble, cette thèse a fourni des preuves
supplémentaires de l'incorporation des microtubules dans le réseau et a permis de
développer de nouvelles techniques permettant d'identifier les caractéristiques de la
stabilisation des microtubules dans l'axone émergent.
Thesis resume
Microtubules form a polar and highly dynamic network that spans throughout the
cytoplasm of eukaryotic cells. Composed of polymerised tubulin dimers, microtubules
create molecular highways to transport molecules around the cell while also playing key
roles in migration, division and defining the morphology of cells. While a large portion of
microtubules are renewed by the growth and collapse in a process called dynamic
instability, some remain stable. Recently, tubulin has been demonstrated to incorporate
into the microtubule lattice at structural defects. This in-lattice incorporation has been
shown to provide an additional mode of microtubule renewal to complement dynamic
instability. To verify this observation in cells, we microinjected labelled tubulin in
epithelial cells and found in-lattice integration occurring along microtubules using super-
resolution fluorescence microscopy. Since microtubules are the backbone of neuronal
morphogenesis and drive the development of the dendrites and axons, we wanted to
explore the occurrence of in-lattice integration in developing neurons. We microinjected
primary hippocampal rat neurons with labelled tubulin before the process of axon
emergence. We paired this with expansion microscopy to better identify single
microtubules within dense bundled microtubule regions. Integration occurred
preferentially on non-acetylated dynamic peripheral microtubules; however, integration
was also observed in the deeper core bundles of stable acetylated microtubules. Further
exploration demonstrated that microtubules in the emerging axon progressively stabilise
as the neuron develops. Using hMB11, an antibody used to detect the GTP conformation
of tubulin, we found that increased hMB11 labelling was evident in the emerging axon.
This occurred in parallel to the stage of axon stabilisation seen in microinjected neurons.
In addition, hMB11 distribution was found to be sensitive to the changes in acetylated
tubulin during development. Together, this thesis has provided further evidence of
microtubule in-lattice incorporation and developed new techniques that can identify
characteristics of microtubule stabilisation within the emerging axon.