Soutenance de thèse de LEFEBVRE DELPHINE
Titre de thèse
Caractérisation de Tle1, une phospholipase antibactérienne du Système de Sécrétion de Type VI de Pseudomonas aeruginosa
Characterization of Tle1, an antibacterial phospholipase from the Pseudomonas aeruginosa Type VI Secretion System
Résumé de la thèse
La bactérie Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste de l'Homme, particulièrement étudiée pour son arsenal de facteurs de virulence. L'un de ses principaux est le système de sécrétion de type VI (T6SS), une nano-arbalète ancrée à la membrane interne, qui cible les bactéries et l'hôte eucaryote. Le T6SS permet l'injection d'effecteurs toxiques (toxines) directement dans les cellules cibles ou libère dans le milieu extracellulaire des effecteurs impliqués dans l'acquisition de métaux. La flèche chargée d'effecteurs est propulsée vers sa cible par la contraction d'un fourreau. P. aeruginosa sécrète un répertoire riche d'une vingtaine d'effecteurs aux activités variées grâce à ses trois T6SS distincts. Cinq d'entre eux appartiennent à la famille des Type VI Lipase Effectors (Tle), des phospholipases qui dégradent la membrane bactérienne depuis le périplasme de la bactérie cible, et certains possèdent également une activité anti-eucaryote non cytotoxique.
Ce projet de thèse se concentre sur Tle1, codé par le gène PA3290. Bien qu'en 2014 sa structure ait été résolue par cristallographie et son activité phospholipase A2 démontrée, Tle1 reste peu caractérisé. Dans le cadre d'un premier objectif, son activité antibactérienne et sa localisation dans la membrane une fois exportée dans le périplasme ont été confirmées chez E. coli. Le gène tle1 est localisé dans un locus orphelin, c'est-à- dire à distance des gènes du T6SS associé à sa sécrétion, le H2-T6SS. Ce locus code quatre autres gènes, dont deux sont candidats pour coder les protéines d'immunité de Tle1, produites par P. aeruginosa pour éviter de succomber aux attaques de cellules sœurs. Pour le deuxième objectif, l'identité de sa protéine d'immunité a été validée par des approches d'interactions protéine-protéine et de prédiction de structure. Les deux autres gènes du locus codent des protéines susceptibles d'être impliquées dans sa sécrétion, une VgrG, protéine de la pointe de la flèche, et une protéine chaperonne ou adaptatrice. Dans le cadre du troisième objectif, un modèle de la fixation de Tle1 à l'extrémité de la pointe du T6SS en interaction avec sa protéine adaptatrice a été généré par AlphaFold 3, et les interactions validées in vivo par des approches de co-purifications et de double hybride bactérien.
Ces travaux s'inscrivent dans les perspectives futures de comprendre comment Tle1 est utilisée par P. aeruginosa pour prendre le dessus sur d'autres bactéries en contexte de compétition, et de tester des éventuelles fonctions anti-eucaryotes, similaires à celles décrites chez d'autres Tle.
Thesis resume
The bacterium Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic human pathogen, extensively studied for its arsenal of virulence factors. One of its key systems is the Type VI Secretion System (T6SS), a nano-crossbow anchored to the inner membrane that targets both bacteria and eukaryotic hosts. The T6SS injects toxic effectors (toxins) directly into target cells or releases effectors into the extracellular environment, where they are involved in metal acquisition. The effector-loaded arrow is propelled toward its target by the contraction of a sheath. P. aeruginosa secretes a rich repertoire of about twenty effectors with diverse activities through its three distinct T6SSs. Five of these belong to the Type VI Lipase Effectors (Tle) family, phospholipases that degrade bacterial membranes from the periplasm of the target bacterium; some also exhibit non-cytotoxic anti-eukaryotic activity.
This PhD project focuses on Tle1, encoded by the PA3290 gene. Although its structure was resolved by crystallography in 2014 and its phospholipase A2 activity demonstrated, Tle1 remains poorly characterized. As a first objective, its antibacterial activity and membrane localization upon export to the periplasm were confirmed in E. coli. The tle1 gene is located in an orphan locus, distant from the genes of the associated H2-T6SS secretion system. This locus encodes four additional genes, two of which are candidates for encoding Tle1 immunity proteins, produced by P. aeruginosa to avoid succumbing to attacks from sibling cells. For the second objective, the identity of its immunity protein was validated through protein-protein interaction approaches and structure prediction. The other two genes in the locus encode proteins likely involved in its secretion: a VgrG protein (the arrow tip) and a chaperone or adaptor protein. As a third objective, a model of Tle1 binding to the tip of the T6SS in interaction with its adaptor protein was generated using AlphaFold 3, and these interactions were validated in vivo through co-purification and bacterial two-hybrid approaches.
This work contributes to future perspectives aimed at understanding how Tle1 is used by P. aeruginosa to outcompete other bacteria in competitive environments and to explore potential anti-eukaryotic functions similar to those described for other Tle effectors.