Soutenance de thèse de NOVELLI Marine
Titre de thèse
Criblage d'inhibiteurs de pompes d'efflux RND chez les bactéries à Gram-négatif et validation biochimique avec la mise au point d'un test de transport in vitro
Screening of RND efflux pump inhibitors in Gram-negative bacteria and biochemical proof-of-concept with the development of an in vitro transport assay
Résumé de la thèse
Un des mécanismes clés de la multirésistance bactérienne est la surexpression des systèmes d'efflux permettant l'export de composés toxiques pour réduire leur concentration intracellulaire sous leur seuil d'efficacité. Les pompes d'efflux RND (Resistance-Nodulation-cell Division), présentes chez les bactéries à Gram négatif, jouent un rôle crucial en extrudant une large gamme de substrats, dont toutes les familles d'antibiotiques. Ces pompes tripartites possèdent un transporteur actif dans la membrane interne qui fonctionne grâce au gradient de protons, un canal de membrane externe et une protéine périplasmique adaptatrice.
Mon projet doctoral était d'identifier des inhibiteurs de pompes d'efflux pour restaurer l'efficacité des antibiotiques. Plus précisément, le projet visait à développer deux méthodologies de criblage applicables sur les bactéries ou sur des pompes reconstituées en protéoliposomes.
Sept molécules dérivées des ianthelliformisamines et des polyaminoisoprényles, identifiées dans la chimiothèque criblée, ont potentialisé les antibiotiques contre des souches résistantes d'E. coli et de P. aeruginosa, et inhibé l'efflux, ce qui en font des candidats prometteurs comme adjuvants. Afin de préciser la spécificité d'inhibition, un protocole de test in vitro optimisé et miniaturisé utilisant des protéoliposomes a été développé. L'activité de transport de la ticarcilline a été démontrée et nous avons déterminé les constantes catalytiques Km et Vmax de la pompe MexAB-OprM vis-à-vis de cet antibiotique. Ces avancées méthodologiques et les résultats obtenus enrichissent la compréhension du fonctionnement de ce transporteur et ouvrent la voie aux criblages de molécules.
Thesis resume
Overexpression of efflux systems is one of the key mechanisms of multidrug resistance, which enables bacteria to expel toxic compounds and reduce their intracellular concentration below the effective threshold. RND (Resistance-Nodulation-cell Division) efflux pumps, found in Gram-negative bacteria, play a crucial role in extruding a wide range of substrates, including all families of antibiotics. These tripartite pumps consist of an active transporter in the inner membrane that operates with the proton gradient, an outer membrane channel, and a periplasmic adaptor protein.
This doctoral project aimed to identify inhibitors of these pumps to restore the efficacy of existing antibiotics. Specifically, the project focused on developing two screening methodologies applicable on bacteria or reconstituted pumps in proteoliposomes.
Seven molecules derived from ianthelliformisamines and polyaminoisoprenyls, identified in the screened chemical library, enhanced the efficacy of antibiotics against resistant strains of E. coli and P. aeruginosa and inhibited efflux, making them promising candidates as therapeutic adjuvants. To determine the specificity of inhibition, an optimized and miniaturized in vitro testing protocol using proteoliposomes was developed. The transport activity of ticarcillin was demonstrated, allowing the determination of the catalytic constants (Km and Vmax) of MexAB-OprM towards this antibiotic. These methodological advancements and results enhance the understanding of this transporter's function and pave the way for future screening of potential inhibitory molecules.