Soutenance de thèse de Juna COMO

L'actine est une protéine du cytosquelette conservée chez tous les eucaryotes. Sa réaction de polymérisation permet aux cellules d'exercer des forces utiles pour de multiples processus cellulaires. Cette dynamique de polymérisation de l'actine est maintenue dans les cellules grâce à l'apport d'énergie, qui est obtenue par une hydrolyse de molécules d'ATP liées à l'actine en ADP. Au cours de ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés au mécanisme de copolymérisation de l'actine en présence de monomères liés à l’ATP et à l’ADP. S’il était connu qu'in vitro, l'actine monomérique liée à l'ADP est capable de polymériser, la réaction de copolymérisation entre actine-ATP et actine-ADP n'a jamais été étudiée en détail. Pour adresser ce problème, nous avons utilisé un nucléotide fluorescent, N6-(6-Amino)hexyl-ATP-ATTO488, qui lie l'actine sans affecter sa cinétique de polymérisation. Nous avons comparé les propriétés de liaison de ce nucléotide et de son équivalent ADP, et avons déterminé que la présence du fluorophore n'affecte pas la capacité relative de ces deux nucléotides à lier l'actine. Nous avons ensuite utilisé ces deux nucléotides fluorescents dans des expériences de copolymérisation, afin de quantifier leur intégration relative au sein de filaments individuels ou de structures organisées d'actine. Nos résultats montrent que l'actine-ATP et de l'actine-ADP copolymérisent, et que les monomères d'actine liés à l'ADP s'intègrent aux filaments d’actine en quantité non négligeable. Pour un grand nombre de conditions étudiées, nos résultats montrent que la probabilité d'intégrer un monomère lié à l'ADP est seulement environ 3 fois inférieure à celle d'intégrer un monomère lié à l'ATP. Ce résultat est surprenant dans la mesure où l'ATP a une affinité 4 fois supérieure pour les monomères par rapport à l'ADP, et que l'actine-ATP est connue pour polymériser beaucoup plus rapidement que l'actine-ADP. Pour comprendre ce résultat, nous avons développé un modèle stochastique reproduisant in silico cette réaction de copolymérisation. Nos résultats révèlent que les mécanismes de la copolymérisation sont plus complexes que celui d'une polymérisation classique de l'actine. En particulier, nos résultats montrent que l'état du nucléotide lié aux sous-unités terminales du filament a une importance cruciale pour le contrôle de cette réaction, permettant une incorporation significative de monomères liés à l'ADP au sein des filaments d'actine. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour comprendre le rôle du nucléotide lié à l'actine lors de la réaction de polymérisation dans la cellule. Alors que la communauté́ scientifique a longtemps estimé que, dans la cellule, la polymérisation d'actine devait se produire exclusivement à partir de monomères liés à l'ATP, nos résultats suggèrent qu'une polymérisation partielle de monomères liés à l'ADP serait crédible.

Actin is a cytoskeletal protein that is conserved in all eukaryotes. Its polymerization reaction enables cells to exert forces that are useful for many cellular processes. The dynamics of actin polymerization in cells is maintained by the supply of energy, which is generated by the hydrolysis of actin-bound ATP molecules to ADP. In this work, we focused on the mechanism of actin copolymerization in the presence of ATP- and ADP-bound monomers. While it is known that ADP-bound monomeric actin can polymerize in vitro, the copolymerization reaction between ATP-actin and ADP-actin has never been studied in detail. To address this problem, we used a fluorescent nucleotide, N6-(6-amino)hexyl-ATP-ATTO488, which binds to actin without affecting its polymerization kinetics. We compared the binding properties of this nucleotide and its ADP equivalent and found that the presence of the fluorophore did not affect the relative ability of these two nucleotides to bind actin. We then used these two fluorescent nucleotides in copolymerization experiments to quantify their relative incorporation into single filaments or organized actin structures. Our results show that ATP-actin and ADP-actin copolymerize, and that ADP-bound actin monomers integrate into actin filaments in non-negligible amounts. For a large number of conditions studied, our results show that the probability of integration of an ADP-bound monomer is only about 3 times lower than that of an ATP-bound monomer. This result was surprising given that ATP has a 4-fold higher affinity for monomers than ADP, and that ATP-actin is known to polymerize much faster than ADP-actin. To understand this result, we developed a stochastic model that reproduces this copolymerization reaction in silico. Our results show that the copolymerization reaction is more complex than expected. In particular, our results show that the state of the nucleotide bound to the terminal subunits of the filament is critical in controlling this reaction, allowing significant incorporation of ADP-bound monomers into actin filaments. These results open new perspectives for understanding the role of actin-bound nucleotide during the polymerization reaction in the cell. While the scientific community has long believed that actin polymerization in the cell occurs exclusively from ATP-bound monomers, our results suggest that partial polymerization of ADP-bound monomers would be credible.