Soutenance de thèse de Nicolas GALLOIS

L'uranium est un radionucléide utilisé pour la production d’énergie dans l’industrie nucléaire. Sa redistribution dans l'environnement est causée par les activités humaines, ce qui entraîne une pollution dans les zones environnantes de cette industrie. Il présente une toxicité radiologique et chimique, causant des problèmes environnementaux et de santé humaine. Les micro-organismes du sol et l'uranium entretiennent des relations complexes qui restent encore peu étudiées. Le but de cette thèse est de comprendre les mécanismes moléculaires des interactions bactéries-uranium à travers l’utilisation de quatre souches bactériennes isolées d’environnements uranifères naturels ou contaminés aux métaux toxiques ou aux radionucléides. Ces quatre souches appartiennent toutes au genre bactérien Microbacterium et présentent un phénotype de tolérance à l’uranium contrasté : deux sont très tolérantes (ViU2a et Hg3), une présente un phénotype intermédiaire (A9) et la dernière est très sensible (ViU22). Lors d’une exposition à l’uranium dans des conditions spécifiques, différents mécanismes d’interactions avec l’uranium interviennent séquentiellement chez ces souches : une première étape de séquestration rapide de l’uranium due à de la biosorption passive, suivie d’une étape active d’efflux d’uranium et de phosphate, observée uniquement chez les souches tolérantes et enfin, une étape d’accumulation active conduisant à la formation intracellulaire de précipités de phosphate d’uranyle. Afin d’identifier les acteurs moléculaires impliqués dans les interactions bactéries-uranium, une analyse comparative basée sur des approches « omiques » a été développée. Le séquençage et l’assemblage des génomes des souches ont été réalisés, aboutissant à la reconstruction d’un seul chromosome. Une analyse protéomique à haut débit a également été effectuée. Elle a porté sur les quatre souches soumises à deux conditions (avec ou sans uranium) avec trois temps de prélèvements correspondant aux trois phases précédemment décrites. Entre 1 500 et 2 500 protéines ont été détectées dont 1 156 à 2 038 validées par au moins deux peptides. L’étude de ces données a montré un impact de l’exposition à l’uranium sur les métabolismes du phosphate et du fer. Cette analyse a également permis d’identifier la protéine UipA (Uranium-Induced Protein A), dont la synthèse est fortement induite en réponse à l’uranyle. Aucun homologue à la protéine UipA n’est détecté chez la souche sensible ViU22. Après purification de la protéine, l’affinité d’UipA pour l’uranium et d’autres cations a été déterminée par des expériences de fluorimétrie. Les résultats obtenus montrent qu’UipA est une protéine très affine et spécifique pour l’uranium et le fer, avec des Kd de l’ordre du nM. L’affinité était moindre pour les autres cations testés. Des analyses spectroscopiques (FTIR et EXAFS) ont permis de caractériser le site de liaison au métal, avec une coordination mono- et bidente pour l’uranium et pour le fer. En amont du gène uipA, deux gènes partageant une homologie de séquence avec le système à deux composants czcRS système connu pour être impliqué dans la tolérance aux métaux de diverses bactéries ont été détectés. Les protéines correspondantes ne sont pas surproduites lors de l'exposition à l'uranium. La protéine UipS possède un domaine conservé « H-box », deux fragments transmembranaires et un domaine senseur extracellulaire. Ce domaine, non annoté, est riche en résidus acides (13,8% Asp et 11,9% Glu), ce qui suggère qu'il est également capable d'interagir avec l’uranium. Les gènes uipA, uipR et uipS sont présents chez les trois souches tolérantes et absents dans la souche sensible (ViU22). L'ensemble de ces données préliminaires suggère que la protéine UipA, associé au système à deux composantes UipRS, est impliqué dans la tolérance à l'uranium.

Uranium is a radionuclide used in nuclear energy. Its redistribution in the environment is caused by human activities causing pollution in surrounding areas. It has radiological and chemical toxicity, causing environmental and human health problems. Soil microorganisms and uranium have complex relationships that have yet to be studied. The goal of this thesis is to understand bacterium-uranium interactions through the use of four bacterial strains isolated from uranium-rich or toxic metals/radionuclide contaminated environments. These four strains all belong to the bacterial genus Microbacterium and have a contrasted uranium tolerance phenotype: two are very tolerant (ViU2a and Hg3), one has an intermediate phenotype (A9) and the latter is very sensitive (ViU22). During exposure to uranium under specific conditions, different mechanisms of interaction with uranium occur sequentially in these strains: a first step of rapid sequestration of uranium due to passive biosorption, followed by an active step of uranium and phosphate efflux, observed only in tolerant strains, and finally, an active accumulation step leading to the intracellular formation of uranyl phosphate precipitates. In order to identify the molecular actors involved in cell-uranium interactions, a comparative analysis based on "omics" approaches is developed. Genome sequencing and assembly of the strains was performed, resulting in the reconstruction of a single chromosome. A proteomic analysis was also performed. It focused on the four strains under two conditions (with or without uranium) with three sampling times corresponding to the three phases previously described. The number of spectra obtained per strain varies between 540 000 and 1 200 000. Between 1 500 and 2 500 proteins were detected of which 1156 to 2038 validated by at least two peptides. The study of these data showed an impact of uranium exposure on phosphate and iron metabolisms. This analysis also identified the protein UipA (Uranium-Induced Protein A), whose synthesis is strongly induced in response to uranyl. No homologue to the UipA protein is detected in the sensitive strain ViU22. After protein purification, the affinity of UipA for uranium and other cations was determined by fluorimetric experiments. The results obtained show that UipA is very affine for uranium and iron, with Kd of the order of nM. Affinity was lower for the other cations tested. The UipA protein is specific of both uranyl and iron. Fourrier Transform Infrared analyses revealed mono- and bidental coordination for uranium and iron. Upstream of the uipA gene, two genes sharing sequence homology with the two-component czcRS system were detected, a system known to be involved in the metal tolerance of various bacteria. The corresponding proteins are not over-produced when exposed to uranium. The UipS protein has a preserved "H-box" domain, two transmembrane fragments and an extracellular sensor domain. This domain, with no annotation in database, is rich in acid residues (13.8% Asp and 11.9% Glu), which strongly suggests that it is also capable of interacting with uranium. The uipA, uipR and uipS genes are present in all three tolerant strains and absent in the susceptible strain (ViU22). All of these preliminary data suggest that the UipA protein, associated with the two-component UipRS system, is involved in uranium tolerance.