Soutenance de thèse de Marie-Charlotte CHAPTAL

L’hypercholestérolémie [taux élevés de cholestérol total et LDL-C] est un facteur de risque majeur des coronaropathies. Durant l'ischémie, l'hypoxie et l'inflammation, l’activation des récepteurs de l’adénosine A2A (A2AR) produit un effet protecteur via ses fonctions vasodilatatrices (en partie coronaire) et immunosuppressives. Des altérations de l'expression et des propriétés des A2AR ont été constatées chez les patients atteints de coronaropathies. Un lien de régulation réciproque entre le cholestérol et A2AR a, en effet, été proposé. Les objectifs de cette thèse étaient : 1) étudier si des altérations des A2AR étaient également associées aux dyslipidémies ; 2) comprendre comment le cholestérol module les A2AR dans le contexte des cellules immunitaires. La première partie de mes travaux consistait à caractériser l’expression et les fonctions des A2AR dans l’hypercholestérolémie. Dans une première étude, nous avons démontré dans une cohorte de 10 patients atteints d’hypercholestérolémie familiale hétérozygote, une diminution significative de l’expression des A2AR dans les PBMC. Ensuite, pour mieux comprendre cette association et le mécanisme subjacent, nous avons caractérisé dans une plus large cohorte de patients atteints d’hypercholestérolémie non traités, sélectionnés principalement sur la base de niveaux élevés de LDL, le lien entre A2AR, le LDL-C plasmatique et le cholestérol intracellulaire, suivi au travers l’expression de la Flotilline 1, une protéine marqueur des domaines intracellulaires membranaires enrichis en cholestérol (radeaux lipidiques). Nos travaux ont montré une diminution significative de l’expression des A2AR en général chez tous les patients ayant un taux élevé de LDL-C plasmatique. De plus, nous avons montré une diminution de l’expression de la Flotilline 1. Ces diminutions d’expression sont corrélées de façon négative avec les concentrations sanguines de LDL-C. Par ailleurs, l’ajout de LDL dans des PBMC d’un sujet sain entraîne une diminution de l’expression des deux protéines. De plus, nous avons trouvé une corrélation positive entre les expressions des A2AR et de la Flotilline 1. Ces résultats nous ont permis de décrire de nouveaux mécanismes qui pourraient expliquer la toxicité due à l’excès de LDL-C : la diminution des A2AR, probablement associée à une diminution des réponses anti-inflammatoires et de la vasodilatation des vaisseaux, pourrait contribuer à augmenter le risque cardiovasculaire associé à l'hypercholestérolémie. En outre, la diminution de la Flotilline 1 suggère un impact plus large du LDL-C sur l'organisation et la fonctionnalité des domaines enrichis en cholestérol de la membrane, ce qui pourrait perturber la voie de signalisation des A2AR et probablement d’autres récepteurs membranaires. La seconde partie de mes travaux portait sur l’effet de la déplétion ou l’augmentation du cholestérol à la membrane plasmique sur la signalisation, l’expression et la localisation des A2AR dans un modèle cellulaire lymphocytaire, les CEM, et dans les PBMC. Nos travaux ont montré que lorsque les CEM sont déplétées en cholestérol à l’aide du méthyl-β-cyclodextrine (MβCD), la capacité maximale de liaison d’Adonis (un anticorps agoniste des A2AR) augmente de façon significative alors que les valeurs de KD et les niveaux d’expression des A2AR restent similaires. En revanche, l’appauvrissement du cholestérol membranaire semble inhiber l’activation de la production d’AMPc par Adonis. Ces résultats préliminaires suggèrent donc que dans ce modèle cellulaire, le cholestérol est essentiel pour la fonctionnalité des A2AR. En conclusion, les deux approches supportent le rôle du cholestérol dans la modulation des A2AR et la présence d’altérations des A2AR associées à l’hypercholestérolémie. Ceci pourrait aider à mieux comprendre le risque cardiovasculaire élevé chez les patients atteints d’hypercholestérolémie. Les A2AR pourraient être un facteur de diagnostic et/ou de pronostic dans l’hypercholestérolémie.

Hypercholesterolemia [high levels of total and LDL cholesterol] is a major risk factor for coronary heart disease. During ischemia, hypoxia and inflammation, activation of the adenosine A2AR receptor (A2AR) produces a protective effect via its vasodilatory and immunosuppressive functions. Alterations in A2AR expression and properties have been found in patients with coronary artery disease. In fact, a reciprocal regulatory link between cholesterol and A2AR was proposed. The aims of this thesis were: 1) to investigate whether A2AR alterations were also associated with dyslipidemia; 2) to understand how cholesterol modulates A2AR in the context of immune cells. The first part of my work involved characterizing A2AR expression and functions in hypercholesterolemia. In a first study, we demonstrated in a cohort of 10 patients with heterozygous familial hypercholesterolemia a significant decrease in A2AR expression in peripheral blood cells (PBMC). Then, to better understand this association and the underlying mechanism, we characterized in a larger cohort of untreated hypercholesterolemic patients, selected mainly on the basis of elevated LDL-C levels, the link between A2AR, blood LDL and intracellular cholesterol, monitored through the expression of Flotillin 1, a protein marker of the cholesterol-enriched intracellular membrane domains (lipid rafts). Our work showed a significant decrease of A2AR and Flotillin 1 expression in general in all patients with high blood LDL-C levels. Incubation of healthy subject PBMC with LDL-excess induced the same effects. A2AR and Flotillin 1 decreased expression correlated negatively with blood LDL-C levels, and positively correlated each other. These results provide insights on new mechanisms that could explain the toxicity of excess LDL-C: the decrease of adenosine A2A receptors, probably associated with a decrease of anti- inflammatory responses and vessels vasodilation, could contribute to increase the cardiovascular risk associated with hypercholesterolemia. In addition, the decrease of Flotillin 1 suggests a broader impact of LDL-C on the organization and functionality of cholesterol-enriched membrane domains, which could disrupt A2AR signaling pathway and possibly other membrane receptors. The second part of my work focused on the effect of depleting or increasing plasma membrane cholesterol on A2AR signaling, expression and localization in a lymphocytic cell model, CEM, and in PBMC. Our work has shown that when CEM are depleted of cholesterol using methyl-β-cyclodextrin (MβCD), the maximal binding capacity of the agonist Adonis increases significantly, while KD values and A2AR expression levels remain similar. In contrast, membrane cholesterol depletion appears to inhibit activation of cAMP production. These preliminary results therefore suggest that in this cellular model, cholesterol is essential for A2AR functionality. In conclusion, both approaches support the role of cholesterol in A2AR modulation and the presence of A2AR alterations associated with hypercholesterolemia. This could help to better understand the high cardiovascular risk in patients with hypercholesterolemia. A2AR could be a diagnostic and/or prognostic factor in hypercholesterolemia.