Soutenance de thèse de Manon PUJOL

Dans un contexte de développement durable, l’industrie chimique se tourne progressivement vers des procédés qui respectent les principes de la chimie verte, via par exemple le remplacement des catalyseurs « chimique » (généralement chers, toxiques et non recyclables) par des enzymes. Cependant, beaucoup de réactions industrielles, comme celles catalysées par les métaux de transition, n’existent pas dans la Nature. Pour surmonter cette limitation, plusieurs protéines hémiques ont été modifiées par évolution dirigée pour catalyser des réactions abiologiques, en particulier des transferts de carbène et nitrène. A côté, seules quelques enzymes non hémiques dépendantes du fer et une protéine à cobalt ont également été décrites pour les transferts de carbène et nitrène alors que d'autres métaux dont le cuivre peuvent les catalyser. Nous avons dans un premier temps cherché à réorienter l'activité d'une classe de métalloenzymes à cuivre impliquées dans la dégradation des polysaccharides récalcitrants, les Lytic Polysaccharide MonoOxygenases (LPMOs), afin de développer de nouveaux biocatalyseurs pour des réactivités non rencontrées dans la Nature. Pour réorienter l'activité des LPMOs, la sphère de coordination du cuivre au sein de la LPMO de Serratia marcescens a été modulée par mutagenèse pour créer de nouveaux motifs de coordination métallique. Plusieurs mutants ont ensuite été caractérisés afin d’évaluer l’impact de ces substitutions sur les propriétés de la liaison au cuivre (affinité, géométrie, propriétés magnétiques). Ces mutants ont ensuite été évalués sur leur capacité à catalyser des réactions non-naturelles (réactions spécifiques au cuivre et transferts de carbène et nitrène). De bonnes activités ont été obtenues pour certaines transformations abiologiques dont un transfert de carbène : le réarrangement de Doyle-Kirmse. Néanmoins, ces activités étant similaires à celle du cuivre en solution, nous nous sommes demandé si les réactions étaient vraiment catalysées au site actif des enzymes. En nous concentrant sur le réarrangement de Doyle-Kirmse, nous avons montré que la LPMO de type sauvage ne perdait pas de manière significative son cuivre dans les conditions réactionnelles. Une perte minime de cuivre, qui catalyserait une partie de la réaction, n’est cependant pas à exclure. En revanche, nous mettons en évidence l’addition d’un carbène sur un résidu du site actif d'un mutant de la LPMO, ce qui entraîne son inactivation et la libération du cuivre. Par la suite, nous avons étendu la gamme des réactions non naturelles catalysées par les hémoprotéines en réalisant pour la première fois par voie enzymatique un réarrangement de Sommelet-Hauser avec une myoglobine évoluée réalisant de bons turnovers et une énantioinduction intéressante.

In the context of sustainable development, chemical industries turn progressively towards processes respecting the criteria of green chemistry, via for example the replacement of chemical catalysts (generally expensive, toxic and non-recyclable) by enzymes. However, lots of industrial reactions, such as those catalyzed by transition metals, do not exist in Nature. To overcome this limitation, several hemoproteins have been engineered by directed evolution to catalyze abiological reactions, in particular carbene and nitrene transfers. Besides, only few non-heme iron-dependent enzymes and one cobalt protein were also reported for carbene and nitrene transfers whereas other metals including copper can catalyze them. We first aimed to repurpose the activity of a class of copper metalloenzymes involved in the degradation of recalcitrant polysaccharides, the Lytic Polysaccharide MonoOxygenases (LPMOs), to develop new biocatalysts for new-to-Nature reactivities. To repurpose the LPMO activity, the copper coordination sphere within the LPMO from Serratia marcescens was modulated by site directed mutagenesis to create new metal coordination motifs. Several mutants were characterized accordingly to evaluate the impact of these substitutions on copper binding properties (affinity, geometry, magnetic properties). These mutants were then assessed for their capacity to catalyze non-natural reactions (specific to copper reactions and carbene and nitrene transfers). Good activities were obtained for some abiological transformations including one carbene transfer : the Doyle-Kirmse rearrangement. Nevertheless, these activities being similar to that of copper in solution, we wondered if the reactions were really catalyzed at the enzyme active site. Focusing on the Doyle-Kirmse rearrangement, we found no evidence that the wild-type LPMO significantly loses some copper from the active site under the reaction conditions. However, a minimal loss of copper which could catalyze part of the reaction cannot be excluded. In contrast, we highlight the carbene addition to an active site residue to a specific LPMO mutant resulting in its inactivation and copper release. Next, we extended the non-natural reactions range catalyzed by hemoproteins by enzymatically performing for the very first time a Sommelet-Hauser rearrangement with an evolved myoglobin achieving good turnover numbers and interesting asymmetric induction.