Soutenance de thèse de Saran PANKAEW

La thymopoïèse a pour but de produire des lymphocytes T exprimant des récepteurs T (TCR) fonctionnels, capables de reconnaître un large éventail d'antigènes étrangers. Tout au long de la différenciation thymique, la qualité des TCRαβ est testée notamment via deux types de sélections : positive et négative. La sélection positive vise à sélectionner les thymocytes qui reconnaissent les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) tandis que la sélection négative élimine les thymocytes reconnaissants des antigènes du soi. Ainsi, la signalisation TCRαβ contrôle le destin des thymocytes (survie/différenciation et mort cellulaire). Les leucémies lymphoblastiques aiguës à cellules T (LAL-T) sont des proliférations malignes de thymocytes. Dans les LAL-T, le gène PTEN est inactivé de façon récurrente et son altération est fréquemment associée aux LAL-T TCRαβ+; dans ce contexte mon laboratoire d'accueil au CIML a montré que la signalisation TCRαβ est directement impliquée dans la leucémogenèse médiée par PTEN. L'objectif principal de mon projet de thèse a été de mieux comprendre l'interaction fonctionnelle entre la signalisation TCRαβ et PTEN afin de décrypter les mécanismes moléculaires déterminant le destin des thymocytes PTEN-déficients vers la leucémie ou la mort cellulaire. En raison de la grande complexité de ces processus biologiques qui impliquent de nombreux composants, j'ai abordé mon projet en utilisant une approche de biologie des systèmes mettant en œuvre du séquençage à haut-débit de cellules uniques (Single-cell RNA sequencing ou scRNA-seq), de l’analyse bioinformatique, de la génétique de la souris et de la modélisation mathématique. Les analyses de nos données scRNAseq ont montré que, par rapport aux thymocytes physiologiques, les thymocytes pathologiques CD4-Cre x Ptenfl/fl (Ptendel) expriment fortement l'oncogène Myc et, comme attendu, présentent un score élevé d'activité de la voie PI3K/AKT. En revanche, notre étude révèle que l'activité de la voie calcium est diminuée dans ces thymocytes pathologiques Ptendel, par rapport à leur contrepartie physiologique. Ces résultats ont été confirmés par les analyses des flux calciques qui montrent que suite à une stimulation de leur TCR, les thymocytes leucémiques sont incapables de libérer les stocks de Ca2+ du réticulum endoplasmique dans le cytosol. Afin de comprendre cette absence de réponse et le rôle de PTEN, j'ai construit un modèle mathématique logique focalisé sur les mécanismes contrôlant le flux calcique, et qui inclut PTEN ainsi que la force de la signalisation TCR. Ce modèle qualitatif reproduit la dynamique rapportée dans la littérature; de plus, l'analyse des mutants PTEN KO a permis d'identifier les récepteurs IP3 (inositol 1,4,5-trisphosphate) (ITPR) comme les éléments clés de l'inhibition du flux calcique. Nous avons ensuite montré expérimentalement que le niveau des protéines ITPR est fortement diminué dans les thymocytes tumoraux PTEN-déficients. Par ailleurs, j’ai débuté une analyse préliminaire de données scRNA-seq multimodales (combinant l'expression génique et expression de protéines de surface), ainsi que l'analyse des clonotypes TCR⍺β. Cette analyse devrait contribuer à une meilleure compréhension de la genèse des leucémies, mais aussi de l'impact du processus de sélection positive sur le destin des thymocytes Ptendel. Dans l'ensemble, mon travail montre qu'une approche interdisciplinaire, impliquant la modélisation mathématique et des technologies de pointe single-cell/bioinformatique, peut contribuer à la compréhension de processus biologiques complexes tels que la leucémogenèse.

Thymopoiesis aims to produce T lymphocytes expressing functional T-cell receptors (TCR) endowed to recognize a wide range of foreign antigens. Throughout thymic differentiation, TCRαβ quality is tested notably via two types of selections: positive and negative. Positive selection aims to select thymocytes that recognize major histocompatibility complex (MHC) molecules while negative selection deletes self-reacting thymocytes. Thus, TCRαβ signalling controls survival and death of thymocytes. T-cell acute lymphoblastic leukemias (T-ALL) are malignant proliferations of thymocytes. In T-ALL, PTEN gene is recurrently inactivated and is frequently associated with TCRαβ+ T-ALL; moreover, my host laboratory (CIML) showed that TCRαβ signalling is directly involved in PTEN-mediated leukemogenesis of thymocytes. The main objective of my thesis project was to better understand the functional interaction between TCRαβ signaling and PTEN in order to decipher mechanisms determining the fate of PTEN-deficient T cells toward leukemia or cell death. Because of the high complexity of this biological process involving many interacting components, I addressed this question with a systems biology approach involving high throughput single-cell bioinformatic approaches, mouse genetics and mathematical modeling. Our scRNA-seq data analyses showed that, compared to physiological thymocytes, pathological CD4-Cre x Ptenfl/fl (Ptendel) thymocytes strongly express Myc oncogene and, as expected, exhibit a high PI3K/AKT pathway activity score. In contrast, the activity of the Calcium pathway is decreased in these pathological Ptendel thymocytes compared to their physiological counterparts. We confirmed the latter results by performing calcium flux analyses that showed that after TCR stimulation, leukemic thymocytes were unable to release Ca2+ from the endoplasmic reticulum into the cytosol. To understand this lack of response and the role of PTEN, I constructed a logical mathematical model that focuses on the mechanisms controlling calcium flux, which includes PTEN and the external TCR signaling. This qualitative model reproduces the dynamics reported in the literature, and analysis of mutant PTEN KO identified IP3 (inositol 1,4,5-trisphosphate) receptors (ITPR) as the key elements of calcium flux inhibition. We then experimentally showed that the level of ITPR proteins is strongly decreased in PTEN-deficient tumoral thymocytes. Besides, my preliminary analysis focused on PTEN involvement before and during leukemogenesis. We decided to use single-cell multimodal data (combining mRNA and surface proteins expression), as well as the analysis of TCR⍺β clonotypes, which should contribute to a better understanding of the impact of positive selection process on the fate of Ptendel thymocytes. Overall, my work shows that an interdisciplinary approach, involving mathematical modelling and cutting-edge single-cell/bioinformatic technologies, has contributed to understand complex biological processes such as leukemogenesis.