Ecole Doctorale

Sciences de la Vie et de la Santé

Spécialité

Biologie-Santé - Spécialité Biologie Végétale

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

Transcription,Phosphate,Imagerie,MS2/MCP,Arabidopsis,Microfluidique

Keywords

Transcription,Phosphate,In vivo Imaging,MS2/MCP,Arabidopsis,Microfluidics

Titre de thèse

Imagerie de la transcription en temps réel pour étudier la perception du phosphate chez les plantes
Real time transcription imaging to study phosphate sensing in plants

Date

Lundi 27 Juin 2022 à 13:30

Adresse

CEA Cadarache- BIAM - Cité des énergies Bâtiment 1900 13108 St Paul lez Durance Amphithéâtre du bâtiment 1900

Jury

Directeur de these M. Laurent NUSSAUME CEA
Examinateur M. Cécile RAYNAUD CNRS
Président M. Stefano CAFFARRI AMU
Examinateur M. Norbert ROLLAND CNRS
Rapporteur M. Gabriel KROUK CNRS
Rapporteur Mme Sandra CORTIJO CNRS

Résumé de la thèse

Le phosphate (Pi) est un macronutriment essentiel au développement des plantes. C'est la seule source de phosphore qui peut être absorbée par les racines. Les plantes ont développé des réponses adaptatives complexes à la carence en Pi, impliquant une régulation très fine de la transcription spatiale et temporelle de plusieurs gènes impliqués dans l'homéostasie du Pi. Afin d'accéder à la cinétique de la transcription in vivo, nous avons développé une technique de marquage et d'imagerie d’ARN basée sur le système MS2-MCP. Ce dernier utilise des séquences d'ARN bactériennes spécifiques qui sont introduites dans le transcrit ciblé. Ces séquences sont reconnues par une protéine virale fusionnée à une GFP, qui s'agglomère sur l'ARNm, offrant la possibilité de le visualiser. En nous basant sur des données de RNAseq, nous avons sélectionné des gènes précoces (SPX1, Unicorn1) de la carence en Pi, qui ont été marqués avec le système rapporteur MS2/MCP-GFP et combinés avec la microfluidique. Ceci a permis de suivre en temps réel la propagation et l’impact du signal phosphate dans les tissus végétaux, avec une résolution spatio-temporelle sans précédent. Toutes les données ont été confirmées par smFISH, validant ainsi la potentialité de la technique utilisée. Nous avons constaté que la répression transcriptionnelle de SPX1 déclenchée par le phosphate dans les racines se produit avec une cinétique rapide (en moins de 5 minutes), et une hétérogénéité entre les cellules voisines. Nous avons également observé de la transcription stochastique (« gene bursting ») et constaté que les allèles actifs ont des fréquences élevées d’initiation de transcription (toutes les 3 secondes) et se regroupent fréquemment dans les cellules polyploïdes. En conclusion, ce système constitue un outil polyvalent permettant d'approfondir les connaissances physiologiques sur l'absorption du phosphate et son utilisation, ainsi que de décrypter les mécanismes moléculaires responsables de signalisation survenant pendant la carence en phosphate. De manière générale, les techniques mises en œuvre élargissent les perspectives et permettent d’aborder de multiples questions physiologiques. De plus, elles donnent accès à la dynamique de l'ARN polymérase II ce qui peut bénéficier à de futures études sur les phénomènes affectant la transcription tels que le bursting, l’extinction génique (‘gene silencing’), l'effet de l'origine parentale des allèles, l'hétérogénéité tissulaire, etc.

Thesis resume

Phosphate (Pi) is an essential macronutrient for plant development. It is the sole source of phosphorus that can be absorbed by the roots. Plants have evolved complex adaptational responses to Pi-scarcity, implicating very fine tuning of the spatial and temporal transcription of several genes involved in Pi-homeostasis. In order to access in vivo to the precise kinetics of transcription we developed an RNA-tagging and imaging technique based on the MS2-MCP system. It makes use of specific bacterial RNA sequences that are introduced in the targeted transcript. These sequences are recognized by a viral protein fused to a GFP, which agglomerates on the mRNA, offering the opportunity to visualize it. We selected through RNA seq experiments early markers (SPX1, Unicorn1) of Pi starvation, which were tagged with the MS2/MCP-GFP reporter system and combined with root microfluidics. This provided the opportunity to follow, in real-time, the propagation of the phosphate signal and its impact in plant tissues, with unprecedented spatio-temporal resolution. All data were confirmed by smFISH, validating therefore the potentiality of the approach. We found that the transcriptional repression of SPX1 triggered in roots by phosphate occurs with unexpectedly fast kinetics (within ~5 minutes), with striking heterogeneity between neighbouring cells. We also observed gene bursting and found that active alleles have high transcription rates (1 initiation every 3sec) and frequently cluster together in polyploid cells. In conclusion, this system constitutes a versatile tool allowing to expand the physiological knowledge on the absorption of phosphate and its use, as well as decipher the molecular mechanisms and signalling processes taking place in response to phosphate deficiency. In general, the techniques implemented broaden perspectives in tackling multiple physiological questions. Additionally, they grant access to single-cell RNA polymerase II dynamics which can benefit future studies of phenomena affecting transcription such as bursting, gene silencing, impact of gametophyte origin, tissue heterogeneity...