Soutenance de thèse de Gabriel HADDAD

Le besoin de méthodes largement applicables pour un diagnostic rapide en microbiologie clinique n'a cessé de croître au cours des dernières décennies. Depuis sa création en 1930, la microscopie électronique à balayage (MEB) est devenue un outil essentiel en microbiologie clinique et en recherche, permettant la visualisation ultra structurale de divers micro-organismes. Son utilisation comme outil de diagnostic a ensuite été réduite avec l'émergence d'outils moléculaires, la spectrométrie de masse et la culture, qui permettent l'identification spécifique des microbes. Récemment, une nouvelle génération de MEB a permis de développer de nouvelles stratégies pour la microbiologie clinique, permettant de réduire significativement le temps et l'expertise nécessaire pour l'acquisition des micrographes. De nouveaux protocoles de préparation et d’imagerie à des fins de diagnostique en routine ont ainsi été développés, pour investiguer une grande variété d'échantillons cliniques. Dans cette thèse, nous avons développé différentes stratégies simples et rapides ciblant les bactéries et les virus dans des échantillons cliniques. L'évaluation de l'état de la viabilité bactérienne présente un grand intérêt pour les microbiologistes. Pour cela, nous avons élaboré une nouvelle méthode d’évaluation de la viabilité basée sur la coloration différentielle à l'acide phosphotungstique des bactéries vivantes et mortes. Ensuite, nous avons optimisé un test en utilisant l’EDX et la MEB. Nous avons défini des modifications de la composition chimique capables de distinguer les bactéries vivantes et mortes après choc thermique, désinfection et traitement antibiotique. Ces méthodes ont été développées pour des applications sur divers types d'échantillons. De plus, nous avons développé une stratégie de détection et d'identification préliminaire rapides des micro-organismes présents dans les hémocultures positives. Nous avons pu acquérir les images dans l'heure suivant la détection du flacon positif, un temps comparable à celui de la coloration de Gram. Nous avons pu regrouper les microbes selon des critères morphologiques, aboutissant à une identification préliminaire allant jusqu’au genre. De plus, nous avons introduit un nouveau test rapide de sensibilité aux antibiotiques par MEB, ciblant 6 bacilles Gram-négatifs et 3 cocci Gram positifs les plus courants, afin d'identifier les modifications ultra-structurelles des souches sensibles après une courte incubation avec les antibiotiques. Cette stratégie réduit le temps de rendement des résultats de 24-48 heures à quelques heures, et est donc capable de répondre aux questions urgentes de diagnostic. La MEB offre une vue panoramique sur l'échantillon, permettant ainsi d'une part de contrôler des cultures fastidieuses et d'autre part d'explorer le microbiote humain par une approche visuelle. Nous avons donc développé des stratégies de préparation rapide et d’imagerie automatisée. Ce balayage automatique, produisant un grand nombre de micrographes, aboutit à une illustration de haute qualité et résolution de l’échantillon en question. Ces méthodes pourraient potentiellement être applicables pour tout type d’échantillons d’intérêt clinique ou de recherche. Dans un deuxième temps, avec la pandémie de SARS-CoV-2, nous avons décrypté le cycle infectieux du virus dans des cocultures cellulaires. Dans une autre étude, nous avons développé une stratégie de détection des virus dans des écouvillons nasopharyngés à l'aide de la MEB. Le MEB est une approche "Attrape-tout" qui permet de surveiller l’émergence de pathogènes inconnus qui ne peuvent pas être ciblés par d'autres méthodes. Les stratégies élaborées dans ce travail sont potentiellement automatisables, et les résultats pourraient être interprétés par intelligence artificielle. Ces travaux ouvrent une nouvelle ère qui pourrait révolutionner la microbiologie clinique, en développant de systèmes à haut débit pour un diagnostic automatisé des maladies infectieuses.

The need for widely applicable methods for rapid clinical microbiology diagnosis has been constantly growing in the last decades. Soon after its creation in the 1930s, scanning electron microscopes (SEM) have been an essential tool in microbiology, allowing the ultrastructural visualization of micro-organisms. The use of diagnostic SEM was later reduced with the emergence of more specific molecular tools, immunoassays, mass spectrometry, and culture, allowing the identification of micro-organisms. Recently, a new generation of SEMs allowed us to develop new strategies for clinical microbiology, due to the reduced acquisition time and required expertise. Also, a variety of clinical samples can be observed with rapid and simple preparation methods. In this thesis, we developed different strategies directly targeting bacteria and viruses in clinical samples, creating, and adapting sample preparation and imaging protocols to be implemented in routine clinical microbiology. First, bacterial viability state evaluation is of great interest for microbiologists, clinician, and environmentalists. Thus, we designed two rapid analyses for determining bacterial vitality in a given sample. First, we established a viability assay based on phosphotungstic acid differential staining of live and dead bacteria. After proving the feasibility of this method, we applied it to evaluate bacterial viability after conservation or after exposure to extreme stress conditions. Second, we optimized a test using EDX coupled to SEM. We defined modifications in the elemental chemical composition capable of distinguishing viable and dead bacteria after heat shock, disinfection, and antibiotic treatment. This method was developed for pure bacterial cultures and generated promising results for further applications after optimizing the preparation and spectral acquisition in more complex samples. Moreover, we developed a strategy coupling rapid imaging to microbial ultra-structure, for a rapid detection and preliminary identification of the micro-organisms present in positive blood cultures. We were able to acquire the micrograph within one hour after the vial is detected positive, a time comparable to that of Gram staining. After SEM acquisition, we were able to cluster the microbes according to morphological differential criteria, reaching a more defined preliminary identification, with data traceability and a reduced consumables cost. Furthermore, we introduced a new rapid SEM antibiotic susceptibility test, targeting 6 Gram-negative rods and 3 Gram-positive cocci of the most common pathogenic species in order to identify potential ultra-structural modifications after a short incubation with antibiotics. This strategy reduces the results yield from 24-48 hours to a couple of hours and is therefore capable of answering urgent diagnosis questions. Also, SEM provides an open view on the sample, thus allowing to directly control fastidious culture on one hand, and on the other, exploring the human microbiota in a graphic approach. For this purpose, we developed robust and reproducible methods, generating a large number of high-resolution micrographs, based on automated sample screening providing full access to the landscape in question. On a second note, with the SARS-CoV-2 pandemic, we deciphered the infectious cycle of the virus in cellular co-cultures. In another study, we developed a screening technique for virus detection in nasopharyngeal swabs using SEM. SEM is a ‘catch-all’ approach that permits monitoring emerging unknown microorganisms that cannot be targeted by other methods. The strategies elaborated in this work are highly automatable, and the results could potentially be interpreted by artificial intelligence. This work opens up a new era which could revolutionize clinical microbiology diagnosis and set us on the track to developing routinely used, high throughput systems for automated infectious diseases diagnosis.