Ecole Doctorale

Sciences de la Vie et de la Santé

Spécialité

Biologie-Santé - Spécialité Biologie du Développement

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

Billes de polyacrylamide,Interaction mécanique,Polarité cellulaire,Actomyosine,Matrice extracellulaire,Adhésion

Keywords

Polyacrylamide beads,Cell mechanics,Cell polarity,Actomyosin,Extra-cellular matrix,Adhesion

Titre de thèse

utilisation de microbilles pour étudier in-situ les forces mécaniques dans des cystes Caco2 polarisés en 3D
In-situ microbeads to study mechanical forces in 3D polarized epithelial Caco2 cysts

Date

Mardi 28 Juin 2022 à 14:00

Adresse

Faculté des sciences 163 Av. de Luminy, 13009 Marseille amphithéâtre CIML

Jury

Directeur de these Mme Dominique MASSEY-HARROCHE Institut de Biologie du Développement de Marseille
CoDirecteur de these Mme Elsa BAZELLIèRES Institut de Biologie du Développement de Marseille
Examinateur M. Guillaume CHARRAS London Centre for Nanotechnology and Department of Cell and Developmental Biology, University College London, London, UK
Examinateur M. Laurent BLANCHOIN Institut de recherche interdisciplinaire de Grenoble
Rapporteur Mme Delphine DELACOUR Institut Jacques Monod
Rapporteur M. Alberto ELOSEGUI ARTOLA Francis Crick Institute

Résumé de la thèse

La morphogenèse et la maintenance des cellules épithéliales reposent sur des interactions finement régulées entre les complexes de polarité, les jonctions cellulaires et les forces mécaniques. Dans le passé, ces interactions ont été largement étudiées le long de l'axe de polarité apico-basal (AB) des cellules épithéliales cultivées sur des substrats plats. Cela inclut la génération de forces par le réseau d'actomyosine polarisé AB, la transmission de forces et la détection de forces. Cependant, les interactions entre ces facteurs restent mal connues dans les systèmes épithéliaux en trois dimensions (3D). Au cours de ma thèse, j'ai voulu étudier ces interactions dans des épithéliums intestinaux humains cultivés en 3D (cystes), un modèle épithélial robuste et physiologique en ce qui concerne la polarité apico-basale et les jonctions cellulaires. Pour étudier les forces mécaniques dans ces cystes, nous avons développé des capteurs de force 3D in situ. Ces capteurs sont des billes de polyacrylamide (PAAm) déformables et fonctionnalisables à la taille des cellules. Ces billes sont marquées de manière discrète ou continue, et leurs surfaces sont fonctionnalisées avec différentes protéines de la matrice extracellulaire (ECM) (collagènes, laminine, fibronectine) ou des protéines de jonction (E-cadhérine). En nous concentrant sur les cystes Caco-2 humains en culture, nous avons d'abord étudié comment la fonctionnalisation des billes par l'ECM affectait l'adhésion bille-cellule et l'intégration de la bille dans les cystes. Les billes fonctionnalisées sont ajoutées au milieu de culture lorsque les cystes sont déjà formés. Après 3 jours d'incubation, certaines billes ont été insérées dans les cystes de manière dépendante de la fonctionnalisation, le Collagène I déclenchant l'insertion la plus efficace. A l'interface cellule-bille, nous avons observé la formation de câbles d'actine dont les extrémités sont colocalisées avec la paxilline, suggérant la formation d'adhésions focales. Le recrutement de la vinculine au sein de ces adhésions suggère fortement que des forces élevées sont exercées à l'interface cellule-bille. Dans les situations où les billes étaient complètement entourées de cellules, nous avons même pu observer une inversion de polarité à l'échelle du tissu, comme le suggère la génération d'une nouvelle couche cellulaire présentant un pôle aPKC tourné vers l'extérieur du cyste, contrairement au reste de celui-ci, où aPKC fait face à la lumière du cyste. Pour analyser les forces, un pipeline d'analyse a été développé. En bref, la surface de la bille a d'abord été reconstruite, puis les forces locales ont été déduites à partir de la déviation mesurée par rapport à une sphère. Enfin, une analyse de corrélation de ces forces avec des marqueurs biologiques nous permettra d'étudier l'interaction entre les paramètres cellulaires (par exemple l’actomyosine, les adhésions, la polarité) et les forces mécaniques. Nos données suggèrent fortement que les billes fonctionnalisées déclenchent des adhésions cellulaires, une réorganisation locale de l'actine et même une réorganisation de la structure du cyste polarisé. C'est la première étude à utiliser ce nouvel outil dans des épithéliums polarisés, ouvrant de nouvelles perspectives dans le décryptage de l'interaction entre la polarité cellulaire et la mécanique.

Thesis resume

Epithelial morphogenesis and maintenance rely on finely regulated interactions between polarity complexes, cell junctions, and mechanical forces. In the past, these interactions have been widely studied along the apico-basal (AB) polarity axis of epithelial cells cultured on flat substrates. This includes force generation by an AB-polarized actomyosin network, force transmission and force sensing. However, the interactions between these factors remain elusive in three-dimensional (3D) epithelial systems. During my thesis, I aimed to study these interactions in 3D cultured human intestine epithelia (cysts), a robust and physiological epithelial model regarding apico-basal polarity and cell junctions. To study the mechanical forces in these cysts, we have developed 3D in situ force sensors. These sensors are custom-made cell-size deformable and functionalizable polyacrylamide (PAAm) beads. These beads are discretely or continuously labeled, and their surfaces are functionalized with different extra-cellular matrix (ECM) proteins (collagens, laminin, fibronectin) or junctional proteins (E-cadherin). Focusing on cultured human Caco-2 cysts, we first studied how ECM bead coating affected bead-cell adhesion and integration of the beads into the cysts. The coated beads are added to the culture medium when the cysts have already formed. After 3 days of incubation, some beads were inserted in the cysts in a coating-dependent manner, with Collagen I triggering the most efficient insertion. At the cell-bead interface, we observed the formation of actin cables whose tips colocalized with paxillin, suggesting the formation of focal adhesions. The recruitment of vinculin within these adhesions strongly suggests that high forces are exerted at the cell-bead interface. In situations where the beads were fully surrounded by cells, we could even observe tissue-scale polarity reversal as suggested by the generation of a new cell layer that exhibited an aPKC pole facing the outside of the cyst, contrasting the rest of the cyst, where aPKC staining faced the lumen. To analyze the forces, an analysis pipeline was developed. Briefly, the bead surface was first reconstructed and from the measured deviation from a sphere local forces were then inferred. Finally, a correlation analysis of these forces with biological markers will allow us to study the interplay between cellular parameters (e.g actomyosin, adhesions, polarity) and mechanical forces. Our data strongly suggest that the functionalized beads trigger cell adhesions, local actin reorganization and even reorganization of the AB-polarized cyst structure. This is the first study to use this new tool in polarized epithelia, opening new perspectives in the deciphering of the interplay between cell polarity and mechanics.