Ecole Doctorale

SCIENCES CHIMIQUES - Marseille

Spécialité

Sciences Chimiques

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

Nanoparticules,Synthèse,Physico-chimique,vectorisation,oligonucléotides,cancer

Keywords

Nanoparticles,Synthesis,Physics and chemistry,vectorization,oligonucleotides,cancer

Titre de thèse

Développement de nanoparticules hybrides et contrôle « moléculaire ». Application à la vectorisation d’oligonucléotides pour la thérapie génique
Development of hybrid nanoparticles and "molecular" control. Application to vectorization of oligonucleotides for gene therapy

Date

Lundi 23 Mai 2022 à 14:30

Adresse

AMU campus Etoile, 52 Av. Escadrille Normandie Niemen, 13013 Marseille Amphithéatre Yvan Massiani

Jury

Examinateur Mme Frédérique CUNIN Université de Montpellier
Examinateur M. Michel CAMPLO Aix Marseille Université
Examinateur M. Marc BARTOLI Université de Aix Marseille
Directeur de these M. Frédéric DALLEMER Université de Aix Marseille
Rapporteur Mme Mona TREGUER-DELAPIERRE Université de Bordeaux
Rapporteur M. Tristan MONTIER Université de Brest

Résumé de la thèse

Les sarcomes des tissus mous sont des tumeurs relativement fréquentes dont le seul traitement efficace reste la résection chirurgicale, mais avec des risques de récidive significatifs. Nous proposons de développer une approche par thérapie génique, promettant permettant une efficacité plus ciblée, avec moins d’effets secondaires. Cette thérapie tire partie de la forte surexpression par les liposarcomes dédifférenciés du gène MDM2, qui intervient dans le mécanisme dégénératif de prolifération cellulaire. Notre objectif est alors de développer l’utilisation d’oligonucléotides antisens (AOS) devant spécifiquement limiter l’expression du gène MDM2. Cependant, il est difficile pour un AOS d’atteindre sa cible à l’intérieur de la cellule, de par sa capacité limitée à traverser les membranes et sa durée de vie réduite. Il est donc nécessaire de développer l’utilisation de vecteurs. Parmi les systèmes envisageables, nous avons développé des nanoparticules, nanoobjets « moléculaires » à synthèses et propriétés de surface contrôlées. Durant ces trois dernières années, j’ai développé et caractérisé différentes nanoparticules hybrides à cœur d’or et surfaces organiques contrôlées (AuNPs). Je dispose alors d’une banque étendue de nanoparticules avec des propriétés spécifiques, avec une surface positive, négative ou neutre. Afin d’en connaitre et maitriser leurs propriétés, je les ai caractérisées grâce aux analyses physico-chimiques. La spectroscopie UV-Visible nous permet d’avoir un aperçu sur la forme sphérique, la taille (à la limite de la présence de la bande de résonnance plasmonique de surface SPR), ainsi que de l’absence d’agglomération sensible des nanoparticules. La résonnance magnétique nucléaire (RMN) nous permet de caractériser la couche organique et son couplage avec le cœur métallique. Grâce aux analyses par thermogravimétrie (ATG) ainsi que microscopie électronique à transmission (MET) nous estimons les compositions moyennes des nanoparticules avec des tailles variant entre 1.9 et 4.8 nm. Enfin les AuNPs sont analysées directement en solution aqueuse par diffusion dynamique de la lumière (DLS), nous permettant de confirmer leur monodispersité en solution. Pour finir, la zêtamétrie nous permet d’estimer le potentiel de surface des AuNPs en solution, seules ou en interaction avec l’oligonucléotide antisens. Nous avons pu alors quantifier le nombre d’AOS interagissant avec les AuNPs en solution et ainsi déterminer le rapport précis AuNPs/AOS utilisable dans les expériences biologiques. A partir du développement de cette banque de AuNPs, nous avons sélectionné dans un premier temps les nanoparticules hybrides à surface positive. Les expériences biologiques in vitro vont permettre d’évaluer trois objectifs majeurs de notre nanosystème : une meilleure pénétration cellulaire, une meilleure efficacité sur la limitation de l’expression du gêne cible MDM2, et enfin une toxicité à court et long terme de l’AOS sur les cellules tumorales de liposarcome IB115. Les résultats ont été obtenus comparativement sur des lignées cellulaires saines (HEK293), cancéreuses surexprimant MDM2 (IB115) et ne surexprimant pas MDM2 (HeLa). Nous avons d’abord pu montrer la non-toxicité de ces nanoparticules sur les lignées cellulaires saines et cancéreuses. Dans un second temps, nous avons montré une meilleure pénétration cellulaire de l’AOS en présence des AuNPs. Nous avons ensuite démontré un effet sensiblement plus efficace contre la gêne cible, en présence d’AOS vectorisées par les AuNPs. Finalement, nous avons montré un effet notable contre la prolifération cellulaire des cellules cancéreuses IB115. Et nous aussi pu montrer l’effet majeur du traitement radiothérapeutique de nos cultures cellulaires par irradiation X, augmentant fortement la cytotoxicité seul, et en présence des AuNPs et AOS. L’ensemble de ces résultats prometteurs va nous permettre de poursuivre cette approche thérapeutique in-vivo, sur un modèle animal.

Thesis resume

Soft tissue sarcomas are relatively common tumours for which the only effective treatment is surgical resection, but with significant risks of recurrence. We propose to develop a gene therapy approach, which promises to provide more targeted efficacy with fewer side effects. This therapy takes advantage of the strong overexpression by dedifferentiated liposarcomas of the MDM2 gene, which is involved in the degenerative mechanism of cell proliferation. Our objective is to develop the use of antisense oligonucleotides (AOS) that specifically limit the expression of the MDM2 gene. However, it is difficult for an AOS to reach its target inside the cell, due to its limited capacity to cross membranes and its short life span. It is therefore necessary to develop the use of vectors. Among the possible systems, we have developed nanoparticles, "molecular" nanoobjects with controlled synthesis and surface properties. During the last three years, I have developed and characterised different hybrid nanoparticles with gold core and controlled organic surfaces (AuNPs). I now have an extensive library of nanoparticles with specific properties, with positive, negative or neutral surfaces. In order to know and control their properties, I have characterised them through physico-chemical analysis. UV-Visible spectroscopy allows us to have an overview of the spherical shape, the size (at the limit of the presence of the surface plasmon resonance band SPR), as well as the absence of agglomeration of the nanoparticles. Nuclear magnetic resonance (NMR) allows us to characterise the organic layer and its coupling with the metallic core. Thanks to thermogravimetric (TGA) and transmission electron microscopy (TEM) analyses, we estimate the average compositions of the nanoparticles with sizes varying between 1.9 and 4.8 nm. Finally, the AuNPs are analysed directly in aqueous solution by dynamic light scattering (DLS), allowing us to confirm their monodispersity in solution. Finally, zetametry allows us to estimate the surface potential of AuNPs in solution, alone or in interaction with the antisense oligonucleotide. We were then able to quantify the number of AOS interacting with the AuNPs in solution and thus determine the precise ratio of AuNPs to AOS that can be used in biological experiments. Based on the development of this library of AuNPs, we first selected hybrid nanoparticles with a positive surface. The in vitro biological experiments will allow us to evaluate three major objectives of our nanosystem: a better cell penetration, a better efficiency on the limitation of the expression of the target gene MDM2, and finally a short and long term toxicity of the AOS on IB115 liposarcoma tumor cells. The results were obtained comparatively on healthy (HEK293), MDM2-overexpressing (IB115) and MDM2-non-overexpressing (HeLa) cancer cell lines. We were first able to show the non-toxicity of these nanoparticles on healthy and cancerous cell lines. In a second step, we showed a better cellular penetration of AOS in the presence of AuNPs. We then demonstrated a significantly more effective effect against the target gene in the presence of AuNPs vectored AOS. Finally, we showed a significant effect against the cell proliferation of IB115 cancer cells. And we were also able to show the major effect of radiotherapeutic treatment of our cell cultures by X-irradiation, strongly increasing cytotoxicity alone, and in the presence of AuNPs and AOS. All these promising results will allow us to pursue this therapeutic approach in-vivo, in an animal model.