Ecole Doctorale

Physique et Sciences de la Matière

Spécialité

PHYSIQUE & SCIENCES DE LA MATIERE - Spécialité : OPTIQUE, PHOTONIQUE ET TRAITEMENT D'IMAGE

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

microscopie de fluorescence,super-résolution,éclairements aléatoires,réflexion totale interne,champ évanescent,illumination structurée

Keywords

fluorescence microscopy,super-resolution,speckle,total internal reflexion,evanescent field,structured illumination

Titre de thèse

Microscopie de fluorescence super-résolue par éclairements aléatoires en configuration de réflexion totale interne
Super-resolved imaging under total internal reflexion using random illumination microscopy

Date

Mardi 24 Mai 2022 à 10:00

Adresse

Institut Fresnel, 52 Avenue Escadrille Normandie Niemen, 13013 Marseille Pierre Coton

Jury

Directeur de these M. Guillaume MAIRE Institut Fresnel UMR 7249, Aix-Marseille Université
Rapporteur Mme Alexandra FRAGOLA Laboratoire de Physique et D’Etudes des Matériaux, ESPCI Paris, PSL Research University, CNRS UMR 8213, Sorbonne Université
Rapporteur Mme Delphine DEBARRE Université Grenoble Alpes, CNRS, Laboratoire interdisciplinaire de physique, CNRS UMR 5588
Examinateur M. Olivier THéODOLY Laboratoire Adhesion et Inflamation, INSERM U1067 CNRS UMR 7333, Aix-Marseille Université
Examinateur M. Martin OHEIM Saints-Pères Paris Institute for the Neurosciences, Université de Paris, CNRS UMR 8118
Président Mme Sandrine LEVêQUE-FORT Université Paris Saclay, Institut des sciences moléculaires d'Orsay, CNRS UMR 8214

Résumé de la thèse

L'observation de structures biologiques au niveau de la membrane cellulaire en microscopie de fluorescence reste difficile. Il s'agit d'observer des objets très fins, peu intenses et peu contrastés à cause de la fluorescence provenant du volume de la cellule. La microscopie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) est une méthode qui consiste à exciter la fluorescence de l'échantillon par un éclairement évanescent sur seulement quelques centaines de nanomètres. La microscopie TIRF est ainsi largement utilisée pour étudier les phénomènes biologiques se passant au voisinage de la lamelle. Cependant, la qualité des images est limitée par une résolution transverse de l'ordre de 200 nm et la présence plus ou moins forte de fluorescence hors focus résiduelle provenant de la diffraction de l'onde évanescente par l'échantillon. Pour améliorer la résolution du TIRF, la configuration SIM (Structured Illumination Microscopy) a déjà été utilisée et permet de gagner un facteur deux sur la résolution. Néanmoins cette méthode est contraignante et difficile à mettre en œuvre car le SIM nécessite une illumination sinusoïdale parfaitement connue. Or lorsque l'on travaille avec de grands angles, aux bords de l'ouverture numérique de l'objectif, ce dernier présente de fortes aberrations ce qui déforme la grille de lumière et rend la reconstruction des images très difficile. Le RIM (Random Illumination Microscopy) dans sa configuration TIRF permet d'atteindre une résolution équivalente au SIM (100 nm) ainsi que d'améliorer le sectionnement optique du TIRF sans avoir besoin de connaitre l'illumination grâce à des éclairements aléatoires. Le RIM est une nouvelle technique de microscopie super-résolue consistant à enregistrer plusieurs images du même échantillon sous des illuminations de speckle (éclairements aléatoires). L’image super-résolue est obtenue avec un algorithme d’inversion (algoRIM) permettant d’estimer l’objet à partir de la variance des images. AlgoRIM repose sur un modèle précis du lien entre la variance et l’objet et tire profit de la fonction d’autocorrélation des speckle pour doubler la résolution sans faire appel à des hypothèses de binarité ou de parcimonie de l’échantillon comme dans la plupart des techniques d’imagerie stochastique. L’intérêt de RIM réside dans sa facilité d’utilisation, en effet il n’est pas nécessaire de contrôler les illuminations. De plus ses performances produisent des images comparables à celles obtenues avec les microscopes super-résolus à éclairement structuré (SIM) nécessitant des illuminations connues. Dans cette étude, nous montrons que RIM peut être adapté à la configuration en réflexion totale pour faire de l’imagerie super-résolue proche de la lamelle. Pour implémenter RIM en configuration TIRF, nous avons modifié un microscope de fluorescence standard en remplaçant la lampe par une diode laser et en introduisant un diffuseur dans un plan conjugué au plan image puis un anneau dans le plan de Fourier de l’objectif. L’anneau est conçu pour laisser passer la lumière selon un cône d’angles supérieurs à l’angle critique entre la lamelle et le milieu où baignent les cellules. L’échantillon est ainsi illuminé avec un speckle évanescent. En tournant le diffuseur, plusieurs centaines d’images sont enregistrées sous différentes réalisations de speckle. Nous avons utilisé le TIRF-RIM sur des échantillons calibrés pour valider le gain en résolution apporté par cette méthode. Ensuite nous avons appliqué le TIRF-RIM à l'imagerie de filaments d'actine dans des cellules fixées en conditions réelles et ainsi démontrer une amélioration significative de la résolution et du sectionnement optique par rapport aux images TIRF. Enfin après validation sur échantillons fixes nous avons utilisé notre système pour l'étude de la dynamique des nanoclusters de paxilline dans des macrophages avec une résolution sans précédent inférieure à 100 nm, obtenue à l'aide d'objectifs TIRF standard d'ouverture numérique 1.49.

Thesis resume

The observation of biological structures at the level of the cell membrane with fluorescence microscopy is difficult. It is a question of observing very fine objects, with low intensity and low contrast because of the fluorescence coming from the volume of the cell. TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) microscopy is a method that consists in exciting the fluorescence of the sample by an evanescent illumination on only a few hundred nanometers. TIRF microscopy is thus widely used to study biological phenomena occurring in the vicinity of the slide. However, the quality of the images is limited by a transverse resolution of about 200 nm and the presence of residual out-of-focus fluorescence due to the diffraction of the evanescent wave by the sample. To improve the resolution of TIRF, the SIM (Structured Illumination Microscopy) configuration has already been used and allows to gain a factor two on the resolution. Nevertheless this method is restrictive and difficult to implement because SIM requires a perfectly known sinusoidal illumination. However, when working with wide angles, at the edges of the numerical aperture of the lens, the latter has strong aberrations which distorts the light grid and makes the reconstruction of images very difficult. RIM (Random Illumination Microscopy) in its TIRF configuration allows to reach a resolution equivalent to SIM (100 nm) as well as to improve the optical sectioning of TIRF without needing to know the illumination thanks to random illumination. RIM is a new super-resolved microscopy technique consisting in recording several images of the same sample under speckle illuminations. The super-resolved image is obtained with an inversion algorithm (algoRIM) allowing to estimate the object from the variance of the images. AlgoRIM relies on an accurate model of the relationship between variance and object and takes advantage of the speckle autocorrelation function to double the resolution without making assumptions about binarity or sample sparsity as in most stochastic imaging techniques. The interest of RIM lies in its ease of use, indeed it is not necessary to control the illuminations. Moreover, its performances produce images comparable to those obtained with super-resolved structured illumination microscopes (SIM) requiring known illuminations. In this study, we show that RIM can be adapted to the total reflection configuration for near-slide super-resolved imaging. To implement RIM in TIRF configuration, we modified a standard fluorescence microscope by replacing the lamp with a laser diode and introducing a diffuser in a plane conjugate to the image plane and then a ring in the Fourier plane of the objective. The ring is designed to let the light pass through a cone of angles greater than the critical angle between the coverslip and the medium in which the cells are immersed. The sample is thus illuminated with an evanescent speckle. By rotating the diffuser, several hundred images are recorded under different speckled illuminations. We used TIRF-RIM on calibrated samples to validate the gain in resolution brought by this method. Then we applied TIRF-RIM to the imaging of actin filaments in fixed cells under real conditions and thus demonstrated a significant improvement in resolution and optical sectioning compared to TIRF images. Finally, after validation on fixed samples, we used our system to study the dynamics of paxillin nanoclusters in macrophages with an unprecedented sub-90 nm resolution, obtained with standard TIRF objectives of numerical aperture 1.49.