Ecole Doctorale

Sciences de la Vie et de la Santé

Spécialité

Biologie-Santé - Spécialité Immunologie

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

L'immunité innée,Macrophage alvéolaires,l'auto-renouvellement,la fibrose pulmonaire,L'identité cellulaire,

Keywords

Innate immunity,Alveolar macrophages,Self-renewal,pulmonary fibrosis,Cellular identity,

Titre de thèse

AUTO-RENOUVELLEMENT DES MACROPHAGES ALVÉOLAIRES MURINS : FIBROSE PULMONAIRE ET IDENTITÉ CELLULAIRE
SELF-RENEWAL OF MURINE ALVEOLAR MACROPHAGES: PULMONARY FIBROSIS AND CELLULAR IDENTITY

Date

Mardi 7 Décembre 2021

Adresse

CIML Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy Parc de Luminy, Case 906 13288 MARSEILLE Cedex 09 FRANCE Amphitheatre

Jury

Directeur de these M. Michael SIEWEKE CIML/Aix Marseille Univeristé/Techniche Universtitat Dresden
Rapporteur Mme Elisa GOMEZ PERDIGUERO Institut Pasteur
Rapporteur Mme Judith ALLEN University of Manchester
Examinateur M. Burkhard BECHER University of Zurich
Examinateur Mme Carole BERRUYER CIML/ Aix Marseille Université
Examinateur M. Philippe NAQUET CIML/ Aix Marseille Université

Résumé de la thèse

Les macrophages sont essentiels à la défense de l'hôte, à la clairance des agents pathogènes et aux processus de régénération tissulaire. Ils diffèrent dans leur ontogenèse, leur localisation et leur fonction. Les macrophages résidant dans les tissus sont issus du sac vitellin, occupent des niches spécifiques et ont une capacité d'auto-renouvellement autonome qui diminue avec l'âge. Les macrophages alvéolaires (MA) résident dans le poumon. A l’homéostasie, ils constituent 90 à 95 % du contenu cellulaire des alvéoles pulmonaires, ce qui en fait les "gardiens" naturels du système respiratoire. Les facteurs de transcription MafB et cMaf sont des acteurs clef contrôlant l'auto-renouvellement des macrophages. Ils inhibent l’expression d’un réseau de gènes d'auto-renouvellement en bloquant les « enhancers » spécifiques des macrophages. A l’homéostasie et au cours du vieillissement, les AM sont maintenus sans contribution majeure des monocytes circulants et expriment de très faibles quantités de MafB et de cMaf. Les AM peuvent être amplifiés en culture, mais on ignore dans quelle mesure ceci affecte leur identité. La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est un problème croissant de santé chez la personne âgée. De plus, de nos jours, la nouvelle maladie pulmonaire Covid-19 peut entraîner une fibrose et rendre la détection de la FPI difficile. Les deux Mafs ont été impliqués dans la FPI, mais la capacité d'auto-renouvellement des AM dans le contexte fibrotique reste inconnue. L'objectif de ma thèse était d'évaluer le rôle de MafB et de cMaf dans l'auto-renouvellement des MA dans le contexte de la fibrose pulmonaire et d'évaluer comment la culture affecte l'identité des MA. Afin d'évaluer le rôle des Mafs dans l'auto-renouvellement des MA dans un contexte de fibrose, nous avons généré des souris déficientes spécifiquement pour l'expression de MafB et cMaf dans les monocytes/macrophages (souris Maf-DKO). La fibrose pulmonaire a été induite ensuite chez les souris par administration intratrachéale de bléomycine. Nous avons observé une amélioration de la survie et une réduction de la fibrose pulmonaire chez les souris Maf-DKO, accompagnées d'une augmentation du nombre de MA résidants et d'une diminution du recrutement de monocytes. En outre, une première analyse transcriptomique a l’échelle unicellulaire des cellules pulmonaires a montré une réduction spectaculaire des macrophages pro-fibrotiques chez les souris Maf-DKO. Nos résultats ont révélé que les Mafs favorisent la fibrose en activant des programmes d'expression génique pro-fibrotique dans les macrophages et ont conduit à l'identification de facteurs clés pour la résolution de la fibrose chez les souris Maf-DKO. Afin d'évaluer dans quelle mesure la culture affecte l'identité des MA, nous avons isolé et développé ex vivo des MA de souris et les avons transplantées dans la niche pulmonaire. Nous avons comparé l'identité cellulaire des MA in vivo, amplifiés ex vivo (exAM) et amplifiés puis transplantés dans le poumon (texAM) en évaluant les marqueurs de surface cellulaire, les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles, les changements dans l'expression des gènes, ainsi que les régions chromatiniennes ouvertes (OCR) par des techniques génomiques de RNA-seq et ATAC-seq. Nous avons observé qu'en dépit des adaptations observées dans les exAMs en raison des conditions de culture, l'identité cellulaire des AM était entièrement maintenue au niveau transcriptomique et épigénétique dans les exAMs et les texAMs. Plus important encore, la transplantation d'exAM a sauvé des souris souffrant de protéinose alvéolaire pulmonaire (PAP), montrant une pleine capacité fonctionnelle lors de la réintégration dans le poumon. Dans l'ensemble, ces résultats soulignent l'importance des mécanismes d'auto-renouvellement des AM in vivo et ex vivo, et jettent les bases d'une utilisation future des macrophages pour les thérapies de transplantation cellulaire dans le poumon et pour le traitement de la FPI.

Thesis resume

Macrophages are critical to host defense, pathogen clearance during infection and in tissue regenerative processes. Macrophages differ in their ontogeny, localization and function. Tissue resident macrophages are yolk-sac derived, occupy specific niches in different tissues of the body and have an autonomous self-renewal capacity that declines with age. Alveolar macrophages (AM) are tissue resident macrophages of the lung. Under homeostasis, AM form 90–95% of the cellular content within the pulmonary alveoli, making them the natural “gatekeepers” of the respiratory system. Transcription factors MafB and cMaf are central players controlling self-renewal mechanisms in terminally differentiated macrophages, like AM. Their activation suppresses the self-renewal gene network by selectively repressing macrophage-specific enhancer elements. AM in homeostasis and normal aging, are maintained throughout adult-life with minimal contribution from circulating monocytes and strikingly, express very low amounts of MafB and cMaf. AM can be expanded in culture, but it is unknown to what extent culture affect their in vivo identity. Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a rising global health concern that affects the elderly with lengthy diagnostic procedures. Moreover, in our days, Covid-19 a new pulmonary disease can result in fibrosis and makes detection of IPF difficult. Interestingly, both the Mafs have been implicated in IPF, however, the self-renewal capacity of AM in the context of pulmonary fibrosis still remains unknown. The goal of my PhD was to evaluate the role of MafB and cMaf in AM self-renewal in the context of pulmonary fibrosis and to assess how culture affects AM in vivo identity. In order to evaluate the role of Mafs in AM self-renewal under fibrotic challenge, we generated mice that specifically lack MafB and cMaf expression in monocytes/macrophages (Maf-DKO mice) by crossing MafB and cMaf floxed mice with Lysozyme M Cre mice. Pulmonary fibrosis was induced in Maf-DKO and WT mice by intratracheal administration of bleomycin. We observed improved survival and reduced lung fibrosis in Maf-DKO mice that was accompanied by an increased number of resident AM and decreased monocytic recruitment. In addition, initial single-cell transcriptomic analysis of whole lungs showed a dramatic reduction of pro-fibrotic macrophages in Maf-DKO versus WT mice. Our results revealed that Mafs drive fibrosis by activating pro-fibrotic gene expression programs in macrophages and led to the identification of key factors driving fibrosis resolution in Maf-DKO mice. In order to assess to what extent culture affect AM in vivo identity, we isolated and expanded mouse AM ex vivo and transplanted them back to the lung niche. We compared the cellular identity of in vivo AM, ex vivo expanded AM (exAM) and exAM transplanted back to the lung (texAM) by evaluating cell-surface markers, morphological and functional characteristics, changes in gene expression, as well as open chromatin regions (OCRs) using bulk RNA and ATAC sequencing. We observed that despite adaptations seen in exAMs due to culturing conditions, the cellular identity of AM was fully maintained at transcriptomic and epigenetic level on exAMs and texAMs. Most importantly, exAM transplantation rescued mice suffering from pulmonary alveolar proteinosis (PAP) showing full functional capacity upon reintegration into the lung. Altogether, these findings highlight the importance of self-renewal mechanisms in AM in vivo and ex vivo and lays a groundwork for future use of macrophages for cell transplantation therapies in the lung and for the treatment of IPF.