Ecole Doctorale
SCIENCES CHIMIQUES - Marseille
Spécialité
Sciences Chimiques
Etablissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
RPE,spectroscopie in cellulo,marquage de spin,proteines chaperones,nitroxyde,
Keywords
EPR,in-cell spectroscopy,spin labels,chaperon proteins,nitroxide,
Titre de thèse
Etude de la dynamique structurale de protéines dans des cellules bactériennes par marquage de spin et spectroscopie RPE : de l'amélioration des méthodes aux études dans les cellules
Protein structural dynamics in bacteria via nitroxide-based SDSL-EPR spectroscopy: from method improvement to in-cell studies
Date
Mardi 16 Novembre 2021 à 13:30
Adresse
31, chemin Joseph Aiguier
CNRS IMM
13009 Marseille Amphithéâtre Pierre Desnuelle
Jury
Directeur de these |
Mme Valérie BELLE |
Aix-Marseille Université |
Examinateur |
Mme Elisabetta MILEO |
CNRS |
Rapporteur |
Mme Daniella GOLDFARB |
Weizmann Institute of Science |
Rapporteur |
M. Guy LIPPENS |
CNRS |
Examinateur |
M. Axel MAGALON |
CNRS |
Examinateur |
M. Olivier OUARI |
Aix-Marseille Université |
Examinateur |
M. Pierre GENEVAUX |
CNRS |
Examinateur |
Mme Barbara ZAMBELLI |
Università di Bologna |
Résumé de la thèse
L'étude des biomolécules dans leur environnement natif, la cellule, est l'un des principaux objectifs de la biologie structurale au cours de la dernière décennie. Ainsi, nous assistons à un remarquable développement des approches dites « in-cell », comme la Cryo-Tomographie Electronique, la microscopie FRET (Förster Resonance Energy Tranfer) et la spectroscopie RMN. Parmi elles, la technique de marquage de spin couplée à la spectroscopie de Résonance Paramagnétique Electronique (SDSL-RPE) présente des caractéristiques intéressantes et avantageuses permettant de sonder la dynamique des protéines à l'intérieur des cellules. En particulier, lutilisation des sondes de type nitroxyde combine sensibilité élevée et absence de contraintes de taille de la biomolécule d'intérêt avec la capacité d'étudier les transitions structurales et les interactions protéines-protéines à température physiologique. Cependant, même si de nombreux efforts ont été faits pour adapter cette technique à des études structurales dans les cellules, des progrès restent à faire.
Dans cette thèse, nous traitons des principales limitations de lutilisation des nitroxydes dans un contexte cellulaire. Nous nous sommes concentrés sur la stabilité des marqueurs nitroxydes dans des milieux reducteurs et dans la cellule, sur lincorporation des protéines marquées dans les cellules et la viabilité de ces cellules en vue de mesures par RPE. Grâce aux résultats obtenus dans cette partie méthodologique, nous avons pu étudier la dynamique structurale de deux protéines chaperons (NarJ de Escherichia coli et UreG de Sporosarcina pasteurii) dans des cellules bactériennes. Ces avancées ont permis de comparer les données obtenues dans le contexte cellulaire à celles obtenues in vitro ou dans un environnement mimant le milieu cellulaire.
Thesis resume
The study of biomolecules in their native environment has been one of the main goals of structural biology in the last decade. As a result, we are assisting to a remarkable increase of new "in-cell" approaches, like Cryo-Electron Tomography, FRET microscopy and NMR spectroscopy. Among these approaches, Site-Directed Spin Labeling (SDSL) coupled to Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy shows competitive and advantageous features to capture protein dynamics inside cells. In particular, nitroxide-based SDSL-EPR combines the advantages of high sensitivity and the lack of size constraints on the biomolecule of interest with the ability to capture protein structural transitions and interactions at physiological temperature. Despite the methodological advancements of the technique that have allowed the community to obtain increasingly relevant results, progresses still need to be done.
In this work, the main limitation of nitroxide-based SDSL-EPR has been addressed. In the first time, we focused on the development of delivery methods to introduce the labeled protein in bacterial cells. Next, the stability of nitroxide labels in reducing environments and in-cell has been assessed, monitoring in parallel the viability of the cells during the EPR measurements.
Thanks to the results achieved in this methodological part, we were able to study the structural dynamics of two flexible chaperone proteins directly in bacterial cells: NarJ from Escherichia coli and UreG from Sporosarcina pasteurii.
Finally, to go further in understanding the impact of the cellular environment on the protein dynamics, the data obtained in cellular context were compared with those obtained in vitro or in a cell-mimicking environment.