Ecole Doctorale
SCIENCES CHIMIQUES - Marseille
Spécialité
Sciences Chimiques
Etablissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
catalyse,electrochimie,hydrogénase,hydrogène,
Keywords
electrochemistry,hydrogen,hydrogenase,catalysis,
Titre de thèse
Études mécanistiques des hydrogénases à FeFe par électrochimie
Mechanistic studies of FeFe hydrogenases by electrochemistry
Date
Jeudi 18 Novembre 2021 à 14:00
Adresse
Laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines.
CNRS, 31, Chemin Joseph Aiguier, CS 70071, 13402 Marseille cedex 09
Salle Jacques Senez
Jury
Directeur de these |
M. Christophe LEGER |
CNRS |
Rapporteur |
M. Yvain NICOLET |
Commissariat à l'Energie Atomique |
Rapporteur |
Mme Silke LEIMKÜHLER |
Universität Potsdam |
Examinateur |
Mme Manon GUILLE-COLLIGNON |
Sorbonne Université |
Examinateur |
Mme Maylis ORIO |
CNRS |
Examinateur |
jalila SIMAAN |
CNRS |
Résumé de la thèse
Les hydrogénases à FeFe sont des enzymes qui catalysent loxydation et la production dhydrogène selon la réaction: 2e- + 2H+ <=> H2. De par leur grande efficacité, ces biocatalyseurs pourraient remplacer le platine dans les (bio-)piles utilisées pour produire de lhydrogène un vecteur dénergie vert. La réactivité de ces enzymes est liée à une position de coordination vacante sur lun des Fe (nommé Fed) du sous-cluster 2Fe de leur site actif. Au cours du cycle catalytique, H2 se lie sur Fed, et cest aussi la cible de linhibiteur O2 qui endommage le site actif. La sensibilité à loxygène de ces enzymes est un frein majeur pour toutes les applications.
Au cours de cette thèse, on a utilisé lélectrochimie de films protéiques (PFE), ainsi que dautres techniques en collaboration, pour étudier en détail divers aspects de la cinétique enzymatique reliées à cette réactivité des hydrogénases à FeFe.
Loxydation de lenzyme en présence de sulfure exogène la rend résistante à O2, parce quelle aboutit à la formation dun état nommé Hinact. Dans cet état, un sulfure est coordonné sur la position vacante de Fed ce qui bloque lattaque de loxygène. Cet état se réactive en réduction. Nous avons étudié le mécanisme de formation et réactivation de cet état en détail en utilisant une combinaison de PFE, de dynamique moléculaire et de calculs DFT. Nous avons aussi étudié la formation de Hinact dans lhydrogénase de Clostridium beijerinckii, ce qui ne nécessite pas de sulfure. En utilisant une combinaison de PFE, de spectroscopie IR, et cristallographie au rayon X et de mutagénèse, nous avons pu montrer que Hinact est formé dans ce cas par la coordination dune cystéine conservée, via un processus qui est très dépendant de la flexibilité de la chaîne protéique. Nous avons montré que des résidus non-conservés distants permettent le déplacement de la cystéine, ce qui démontre un contrôle à distance de la chimie du site actif.
Nous avons par ailleurs caractérisé les propriétés cinétiques dune hydrogénase de Desulfovibrio fructosovorans qui réalise la bifurcation délectrons, ainsi que des mutants de lhydrogénase de C. reinhardtii conçus dans le but daffecter la diffusion intramoléculaire de gaz. Notre but était de comprendre comment les inhibiteurs se déplacent à lintérieur de lenzyme jusquau site actif.
Nous nous sommes enfin intéressés à la dernière étape de la maturation de lenzyme linsertion du sous-cluster 2Fe dans une enzyme qui en est dépourvue au sein dun film de polymères rédox.
En résumé, via une approche multidisciplinaire combinant électrochimie, biologie moléculaire, biochimie et approches théoriques, nous avons pu faire avancer la compréhension des mécanismes de protection des hydrogénases à FeFe contre l'oxygen; nous avons aussi pu mettre en évidence des effets à longue distance de résidus sur la chimie du site actif.
Thesis resume
FeFe hydrogenases are enzymes that catalyse the oxidation and production of hydrogen: 2e- + 2H+ <=> H2. With their high efficiency, these biocatalysts are potent candidates to replace platinum in (bio-)fuel cells to generate the "green" energy carrier hydrogen. The reactivity of these enzymes is in particular linked to a free coordination site (called Fed) on the 2Fe sub-cluster of its active site. In the catalytic cycle, H2 binds to Fed, whereas O2 binding to this site damages the enzyme. The oxygen sensitivity of hydrogenases is a major drawback for any potential application of these enzymes. In this work, we used protein film electrochemistry (PFE) in collaboration with different other techniques to study various aspects of enzyme kinetics in relation to this reactivity in detail.
Oxidation in the presence of exogenous sulfide makes the enzyme resistant to O2. Indeed, this leads to an inactive state of the enzyme called Hinact, in which Fed is coor-dinated by a sulfide ligand; the latter blocks oxygen attack. This oxygen resistant, inactive state can be reactivated by reduction. We describe the mechanism of this reaction in detailby using a combination of PFE studies, MD and DFT calculations. Furthermore, we extensively studied the reversible, sulfide-independant formation of the same Hinact state in the FeFe hydrogenase from Clostridium beijerinckii. Using PFE, IR spectroscopy, XRD crystallography and site-directed mutagenesis, we discovered that Hinact is formed by the coordination of a conserved cysteine sulfide, in a process that is very dependent on the flexibility of the protein backbone. We show that up to 13Å distant, non-conserved amino acids enable the translocation of the cysteine residue, and thus remotely control active site chemistry.
We also characterised the kinetic properties of the bifurcating hydrogenase from Desulfovibrio fructosovorans as well as mutants of the enzyme from C. reinhardtii designed to influence gas diffusion along proposed intramolecular diffusion pathways. We aimed to elucidate how these inhibitors travel to the active site and how this affects the inhibition kinetics. Finally, we probed the last step of the enzyme maturation the insertion of the2Fe cluster into the apo-enzyme in a redox polymer film.
In summary, using a multidisciplinary approach that combines state-of-the-art electrochemistry, molecular biology, biochemistry and theoretical methods, we advanced the understanding of oxygen protection mechanisms in FeFe hydrogenases. We also demonstrated the long range influence of several residues on the active site chemistry.