Ecole Doctorale

SCIENCES CHIMIQUES - Marseille

Spécialité

Sciences Chimiques

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

catalyse,electrochimie,hydrogénase,hydrogène,

Keywords

electrochemistry,hydrogen,hydrogenase,catalysis,

Titre de thèse

Études mécanistiques des hydrogénases à FeFe par électrochimie
Mechanistic studies of FeFe hydrogenases by electrochemistry

Date

Jeudi 18 Novembre 2021 à 14:00

Adresse

Laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines. CNRS, 31, Chemin Joseph Aiguier, CS 70071, 13402 Marseille cedex 09 Salle Jacques Senez

Jury

Directeur de these M. Christophe LEGER CNRS
Rapporteur M. Yvain NICOLET Commissariat à l'Energie Atomique
Rapporteur Mme Silke LEIMKÜHLER Universität Potsdam
Examinateur Mme Manon GUILLE-COLLIGNON Sorbonne Université
Examinateur Mme Maylis ORIO CNRS
Examinateur jalila SIMAAN CNRS

Résumé de la thèse

Les hydrogénases à FeFe sont des enzymes qui catalysent l’oxydation et la production d’hydrogène selon la réaction: 2e- + 2H+ <=> H2. De par leur grande efficacité, ces biocatalyseurs pourraient remplacer le platine dans les (bio-)piles utilisées pour produire de l’hydrogène – un vecteur d’énergie “vert”. La réactivité de ces enzymes est liée à une position de coordination vacante sur l’un des Fe (nommé Fed) du sous-cluster 2Fe de leur site actif. Au cours du cycle catalytique, H2 se lie sur Fed, et c’est aussi la cible de l’inhibiteur O2 qui endommage le site actif. La sensibilité à l’oxygène de ces enzymes est un frein majeur pour toutes les applications. Au cours de cette thèse, on a utilisé l’électrochimie de films protéiques (PFE), ainsi que d’autres techniques en collaboration, pour étudier en détail divers aspects de la cinétique enzymatique reliées à cette réactivité des hydrogénases à FeFe. L’oxydation de l’enzyme en présence de sulfure exogène la rend résistante à O2, parce qu’elle aboutit à la formation d’un état nommé Hinact. Dans cet état, un sulfure est coordonné sur la position vacante de Fed ce qui bloque l’attaque de l’oxygène. Cet état se réactive en réduction. Nous avons étudié le mécanisme de formation et réactivation de cet état en détail en utilisant une combinaison de PFE, de dynamique moléculaire et de calculs DFT. Nous avons aussi étudié la formation de Hinact dans l’hydrogénase de Clostridium beijerinckii, ce qui ne nécessite pas de sulfure. En utilisant une combinaison de PFE, de spectroscopie IR, et cristallographie au rayon X et de mutagénèse, nous avons pu montrer que Hinact est formé dans ce cas par la coordination d’une cystéine conservée, via un processus qui est très dépendant de la flexibilité de la chaîne protéique. Nous avons montré que des résidus non-conservés distants permettent le déplacement de la cystéine, ce qui démontre un contrôle à distance de la chimie du site actif. Nous avons par ailleurs caractérisé les propriétés cinétiques d’une hydrogénase de Desulfovibrio fructosovorans qui réalise la bifurcation d’électrons, ainsi que des mutants de l’hydrogénase de C. reinhardtii conçus dans le but d’affecter la diffusion intramoléculaire de gaz. Notre but était de comprendre comment les inhibiteurs se déplacent à l’intérieur de l’enzyme jusqu’au site actif. Nous nous sommes enfin intéressés à la dernière étape de la maturation de l’enzyme – l’insertion du sous-cluster 2Fe dans une enzyme qui en est dépourvue –au sein d’un film de polymères rédox. En résumé, via une approche multidisciplinaire combinant électrochimie, biologie moléculaire, biochimie et approches théoriques, nous avons pu faire avancer la compréhension des mécanismes de protection des hydrogénases à FeFe contre l'oxygen; nous avons aussi pu mettre en évidence des effets à longue distance de résidus sur la chimie du site actif.

Thesis resume

FeFe hydrogenases are enzymes that catalyse the oxidation and production of hydrogen: 2e- + 2H+ <=> H2. With their high efficiency, these biocatalysts are potent candidates to replace platinum in (bio-)fuel cells to generate the "green" energy carrier hydrogen. The reactivity of these enzymes is in particular linked to a free coordination site (called Fed) on the 2Fe sub-cluster of its active site. In the catalytic cycle, H2 binds to Fed, whereas O2 binding to this site damages the enzyme. The oxygen sensitivity of hydrogenases is a major drawback for any potential application of these enzymes. In this work, we used protein film electrochemistry (PFE) in collaboration with different other techniques to study various aspects of enzyme kinetics in relation to this reactivity in detail. Oxidation in the presence of exogenous sulfide makes the enzyme resistant to O2. Indeed, this leads to an inactive state of the enzyme called Hinact, in which Fed is coor-dinated by a sulfide ligand; the latter blocks oxygen attack. This oxygen resistant, inactive state can be reactivated by reduction. We describe the mechanism of this reaction in detailby using a combination of PFE studies, MD and DFT calculations. Furthermore, we extensively studied the reversible, sulfide-independant formation of the same Hinact state in the FeFe hydrogenase from Clostridium beijerinckii. Using PFE, IR spectroscopy, XRD crystallography and site-directed mutagenesis, we discovered that Hinact is formed by the coordination of a conserved cysteine sulfide, in a process that is very dependent on the flexibility of the protein backbone. We show that up to 13Å distant, non-conserved amino acids enable the translocation of the cysteine residue, and thus remotely control active site chemistry. We also characterised the kinetic properties of the bifurcating hydrogenase from Desulfovibrio fructosovorans as well as mutants of the enzyme from C. reinhardtii designed to influence gas diffusion along proposed intramolecular diffusion pathways. We aimed to elucidate how these inhibitors travel to the active site and how this affects the inhibition kinetics. Finally, we probed the last step of the enzyme maturation – the insertion of the2Fe cluster into the apo-enzyme – in a redox polymer film. In summary, using a multidisciplinary approach that combines state-of-the-art electrochemistry, molecular biology, biochemistry and theoretical methods, we advanced the understanding of oxygen protection mechanisms in FeFe hydrogenases. We also demonstrated the long range influence of several residues on the active site chemistry.