Soutenance de thèse de Ziyan FANG

Les salmonelles sont des bactéries intracellulaires qui résident dans une vacuole. Après l'entrée d'une bactérie dans une cellule hôte, la vacuole mûrit le long de la voie endocytique. La composition de la membrane de la vacuole mature, qui permet la réplication bactérienne, est très similaire à celle des lysosomes. Cette vacuole forme des tubules qui s’étendent le long du cytosquelette de microtubules jusqu'à la périphérie cellulaire. Ces tubules favorisent les échanges membranaires avec les vésicules de l'hôte et permettent l’acquisition des nutriments nécessaires à la prolifération bactérienne. Le processus de formation des tubules est orchestré par les effecteurs de Salmonella, qui sont transférés du cytoplasme bactérien au cytosol de la cellule hôte par un système de sécrétion de type 3. Ces effecteurs interagissent et recrutent des protéines de l'hôte sur le compartiment bactérien. C'est le cas de la kinésine-1, un moteur moléculaire qui se déplace le long des microtubules et qui, dans les cellules infectées, permet l'extension des tubules associés au compartiment vacuolaire de Salmonella. La kinésine-1 est recrutée, d'une part, par le complexe composé de l'effecteur de Salmonella SifA et de la protéine hôte SKIP et, d'autre part, par une interaction directe avec l'effecteur de Salmonella PipB2. Dans le projet 1, nous avons étudié le rôle de KIF1Bß, un membre de la famille des moteurs moléculaires kinesin-3, dans la formation du compartiment intracellulaire de Salmonella et le positionnement des lysosomes. Nous avons montré que SifA interagit et recrute la kinésine-3 sur les vacuoles de Salmonella et que l'activité de ce moteur moléculaire est essentielle pour la dynamique membranaire des vacuoles bactériennes. Arl8, une GTPase lysosomale, interagit directement avec la kinésine-3 et est essentielle pour son recrutement lysosomal. Bien que présente sur les vacuoles de Salmonella, l'absence d'Arl8 a peu ou pas d'impact sur le recrutement de la kinésine-3. Dans le contexte non-infectieux, SKIP est recruté aux lysosomes via Arl8. Nous montrons que SKIP interagit avec la kinésine-3 et participe à son recrutement sur une partie des lysosomes. SifA, sur la vacuole de Salmonella, remplit des fonctions qui sont celles d'Arl8 sur les lysosomes. Cette étude fournit un exemple de l'adaptation des bactéries intracellulaires et de leur capacité à mimer certaines fonctions cellulaires. En absence de cargo, la kinésine-1 est auto-inhibée. Notre équipe a précédemment montré que l'effecteur PipB2 se lie à la kinésine-1 et l'active, permettant son engagement sur les microtubules. La kinésine-1 interagit avec de nombreuses protéines en reconnaissant des motifs constitués d'un résidu tryptophane (W) ou tyrosine (Y) flanqué de résidus acides, appelés respectivement motifs W-acide et Y-acide. PipB2 contient deux motifs Y-acide. Dans le projet 2, nous avons étudié le rôle du motif Y-acide C-terminal de PipB2. Nous avons montré que PipB2 a une localisation et un impact différents dans les cellules HeLa et Cos-7 et que la tyrosine du motif Y-acide est phosphorylée. Nous avons créé plusieurs mutants de ce motif et du motif L341FNEF345. Ce dernier, qui recouvre partiellement le motif Y-acide, est nécessaire au transport centrifuge des lysosomes dans les cellules HeLa exprimant PipB2. Nous avons constaté que, pour certains mutants, PipB2 et la localisation des lysosomes étaient découplés. Ce phénomène a également été observé dans des cellules HeLa exprimant PipB2 et de faibles niveaux de kinésine-1. Nous avons également constaté que certaines mutations ont un impact sur la capacité de PipB2 à activer la kinésine-1. En résumé, cette étude met en évidence le rôle important du motif Y-acide dans les fonctions de PipB2.

Salmonella are intracellular bacteria that reside within a vacuole. Following entry of a bacterium into a host cell, the vacuole matures along the endocytic pathway. The membrane composition of the mature vacuole that supports bacterial replication is very similar to that of lysosomes. This vacuole extrudes tubules along the microtubule cytoskeleton to the cell periphery. The formation of Salmonella tubules promotes membrane exchange with host vesicles and thus provides nutrients for bacterial proliferation. The process of tubule formation is orchestrated by Salmonella effectors, which are transferred from the bacterial cytoplasm to the cytosol of the host cell by a needle-like secretion system. These effectors interact and recruit host proteins to the bacterial compartment. This is the case for kinesin-1, a molecular motor that moves along microtubules and, in infected cells, allows the extension of tubules associated with the Salmonella membrane compartment. Kinesin-1 is recruited by the complex of the Salmonella effector SifA and the host protein SKIP on the one hand and by a direct interaction with theSalmonella effector PipB2 on the other. In project 1, we investigated the role of KIF1Bß, a member of the kinesin-3 family of molecular motors, in the formation of the Salmonellaintracellular compartment and the positioning of lysosomes. We show that SifA interacts and recruits kinesin-3 to Salmonella vacuoles and that the activity of this molecular motor is essential for the membrane dynamics of bacterial vacuoles. Arl8, a lysosomal GTPase interacts directly with kinesin-3 and is essential for its recruitment to lysosomes. Although present on Salmonella vacuoles, the absence of Arl8 has little or no impact on the recruitment of kinesin-3 to this bacterial compartment. In the non-infectious context, SKIP is recruited to lysosomes via Arl8. We show that SKIP interacts with kinesin-3 and participates in its recruitment to part of the lysosomes. SifA, on the Salmonella vacuole, performs functions that are those of Arl8 on lysosomes. This study provides an example of the adaptation of intracellular bacteria and their ability to mimic certain cellular functions. In the absence of cargo, kinesin-1 is auto-inhibited. Our team has previously shown that the Salmonella effector PipB2 binds and activates kinesin-1 allowing its engagement with microtubules and the transport of cargo. Kinesin-1 interacts with many proteins by recognizing motifs consisting of a tryptophan (W) or tyrosine (Y) residue flanked by acidic residues, called W-acidic and Y-acidic motifs, respectively. PipB2 contains two possible Y-acidic motifs. In project 2, we investigated the role of the C-terminal Y-acidic motif of PipB2. First, we show that PipB2 has a different localization and impact in HeLa and Cos-7 cells and that the tyrosine of the Y-acidic motif is phosphorylated. We have engineered several mutants of the Y-acidic motif and the L341FNEF345 motif. The latter, which partially overlaps the Y-acidic motif, is required for centrifugal transport of lysosomes, a phenotype associated with ectopic expression of PipB2 in HeLa cells. We found that for some mutants, PipB2 and lysosome localization were uncoupled. This phenomenon was also observed in HeLa cells expressing PipB2 and low levels of kinesin-1. We also found that certain mutations impact the ability of PipB2 to activate kinesin-1. In summary, this study highlights the important role of the acid-Y motif in the functions of PipB2.