Soutenance de thèse de Dehia SAHMI

L’un des grands bouleversements du monde viral est représenté par la découverte en 2003 de Mimivirus, premier virus géant par la taille de sa particule et de son génome. S’ensuit celle du virophage Sputnik, virus satellite-like dépendant d’un premier parasitisme de sa cellule hôte par un virus géant pour installer son propre parasitisme sur ce virus géant, pour lequel il peut être délétère. Cette interrelation virophage-virus géant-cellule hôte, semble avoir co-évolué dans le temps conduisant à la découverte de modèles d’interaction de plus en plus complexes. La première partie de la thèse est consacrée exclusivement aux différentes revues scientifiques qui englobent et mettent à jours les diverses connaissances sur les nouveaux membres virophages-virus géants-cellules hôtes déterminant une nouvelle co-évolution. Dans une phase exploratoire de cette tripartie, j’ai commencé à m’intéresser à l’une des familles des virus géants : les Marseilleviridae. Leurs découvertes, leurs isolements et les techniques mises au point pour ce fait, leur diversité, la compréhension de leurs cycles de réplication. S’ensuit un travail d’analyse sur un ensemble de génomes viraux, avec étude phylogénétique ainsi qu’une classification de cet ensemble, leurs détections chez l’homme et leurs relations avec la pathologie humaine. Toujours dans la phase d’exploration, j’ai apporté ma contribution à la mise à jour des connaissances sur les virophages depuis la découverte de Sputnik en 2007 jusqu’à Sissivirophage en 2019. Pour finir, une revue scientifique synthétique, de contribution de l’ensemble des personnes ayant apporté leurs expertises au sein de l’IHU de Marseille ou à travers de riches collaborations, depuis 2003 jusqu’en 2019 vient clôturer l’état de l’art concernant ce ménage à trois. Mes travaux de recherche ont appliqué les techniques de micro-manipulation pour l’étude des virus géants. J’ai constitué le poste de travail du microinjecteur, composé de deux éléments essentiels, le CellTram® 4r Oil, micro-injecteur hydraulique manuel et le FemtoJet® 4i, microinjecteur programmable avec alimentation en pression intégrée, l’ensemble couplé au micromanipulateur InjectMan® 4. Lors de la deuxième partie de ma thèse, j’ai détourné la fonction du CellTram® 4r Oil, habituellement utilisé pour assister le FemtoJet® 4i dans la microinjection de cellules en suspension, dans une fonction de prélèvement de cellules individuelles en suspension ou en faible adhérence. Dans un premier travail, cette technique a été utilisé comme moyen de clonage de virus géants en mélange ayant permis d’isoler Clandestinovirus et Usurpativirus, premiers virus géants non lytiques. Ces virus n’avaient pas pu être isolés par les moyens conventionnels habituels de clonage par dilution ou par trieur FACS à cause de leur faible abondance dans une co-habitation dans l’amibe Vermamoeba vermiformis avec le virus Faustovirus en forte abondance. La troisième partie de ma thèse s’est focalisée sur le FemtoJet® 4i, habituellement utilisé pour la microinjection de cellules, afin de déterminer si l’ADN de Mimivirus seul suffisait pour produire une infection de l’amibe A. castellanii. La difficulté technique a consisté dans la mise au point d’un protocole pour l’utilisation du FemtoJet® 4i sur l’amibe, une cellule à faible adhérence et avec des changements de conformations constants, rendant la fixation des paramètres, et par conséquent les microinjections reproductibles en série, très difficiles. Après optimisation du protocole, nous avons pu vérifier que l’ADN de Mimivirus seul ne suffisait pas pour produire une infection de l’amibe A. castellanii et qu’au moins la protéine hypothétique L442 auquel il était très fortement lié était indispensable. Ces résultats ouvrent plusieurs pistes potentielles pour des travaux futurs portant sur l’application de la micromanipulation pour l’étude des virus géants mais plus généralement pour tous les micro-organismes à croissance intracellulaire

One of the great shifts in the viral world is represented by the discovery in 2003 of Mimivirus, the first giant virus in regard to the size of its particles and its genome. This was followed by the discovery of Sputnik virophage, a satellite-like virus dependent on a first parasitism of its host cell by a giant virus to install its own parasitism on this giant virus for which it can be harmful. This virophage-giant virus-host cell interrelation, seems to have co-evolved over time, leading to the discovery of increasingly complex models of interaction. The first part of the thesis is dedicated exclusively to the various scientific review articles which include and update the knowledge on the new virophages-giant virus-host cell members determining a new co-evolution: In an exploratory phase of this tripartite, I had interest in one of the giant virus families: the Marseilleviridae. Their discovery, their isolations and the techniques developed for this purpose, their diversity, the understanding of their replication cycles. This is followed by an analysis on a set of viral genomes available on the NCBI database, and some in the data base of the IHU of Marseille, with a phylogenetic study as well as a classification of this set of viruses, their detections in humans and their relationship with human pathology. In this phase of exploration of the different concepts surrounding virophages-giant viruses-host cells complex, I contributed to updating knowledge on virophages from the discovery of Sputnik in 2007 to Sissivirophage in 2019. To finish this initial part, a synthetic collaborative review of all the people who brought their expertise within the IHU of Marseille or through rich collaborations since 2003 until 2019 comes to close the state of the art about this threesome. My research applicated the micro-manipulation techniques for the study of giant viruses. I set up the workstation for the microinjector, composed of two essential elements, the CellTram® 4r Oil, manual hydraulic micro-injector and the FemtoJet® 4i, programmable microinjector with integrated pressure supply, all coupled to the InjectMan® micromanipulator 4. During the second part of my thesis, I diverted the function of CellTram® 4r Oil, usually used to assist FemtoJet® 4i in the microinjection of cells in suspension, in a function of collecting individual cells in suspension or in weak adhesion. In my first work, this technique has been used as a means of cloning giant viruses in a mixture allowing the isolation of Clandestinovirus and Usurpativirus, the first non-lytic giant viruses. These viruses could not be isolated by the conventional techniques, the end point dilution and the FACS sorter, due to their low abundance in cohabitation in Vermamoeba vermiformis with high abundance of Faustovirus. The third part of my thesis focused on FemtoJet® 4i, commonly used for cells microinjection, to determine whether Mimivirus DNA alone was sufficient to produce the infection of A. castellanii. The development of a FemtoJet® 4i protocol on amoeba was technically fastidious. These cells have a low adherence and constants changes of conformation, making fixation of parameters and consequently serial reproducible microinjections very difficult. After protocol optimization, we were able to verify that the DNA of Mimivirus alone was not sufficient to produce an infection of the amoeba A. castellanii, its link to the hypothetical protein L442 is necessary. These results open up several perspectives for the future work on the application of micromanipulation for the study of giant viruses and generally for all microorganisms with intracellular growth.