Soutenance de thèse de Alexandre TASSIN DE NONNEVILLE

Le maintien des télomères est nécessaire pour que les cellules néoplasiques prolifèrent indéfiniement et peut se produire par la réactivation de la télomérase ou par un processus basé sur la recombinaison, present dans 10 à 15 % des tumeurs, appelé Alternative lengthening of telomeres (ALT). La perte de fonction dans l'axe ATRX/DAXX/H3.3 fait partie des alterations associée au l'ALT. Les ostéosarcomes sont des tumeurs agressives connues pour utilizer le ALT à une fréquence élevée. Contrairement à d'autres types de tumeurs, l'inactivation d'ATRX ne se produit que dans 30 % des cas. Cette discordance entre un niveau élevé de ALT et une faible proportion d'inactivation d'ATRX m'a conduit à l'hypothèse que l'inhibition du ALT médiée par ATRX pourrait être contournée dans certaines conditions. Le but de ce projet était d'identifier ces conditions en effectuant des analyses multi-omiques sur des tumeurs de patients, et de valider fonctionnellement l'implication des meilleurs candidats dans des modèles de lignées cellulaires. À partir d'une cohorte pédiatrique de patients atteints d’osteosarcomes de haut grade strictement localisés et naïfs de tout traitement, j’ai identifié 73% des tumeurs avec un phenotype ALT, (C-circles et hétérogénéité de la longueur des télomères par FISH et TesLA). L'analyse supervisée des données NGS et CGH a identifié des altérations significatives dans des gènes précédemment impliqués dans le ALT (ATRX, XRCC5, SMARCAL1, DCLRE1B/Apollo, TOP3A, SP100). L’amplification de TOP3A en CGH s’est révélée mutuellement exclusive avec l'inactivation d'ATRX dans les tumeurs ALT. Une analyses transcriptomique a ensuite confirmé une correlation entre amplification et surexpression de TOP3A. En accord avec les données observes dans les tumeurs, nous avons retrouvé seulement 36% d’inactivation d’ATRX dans les lignées cellulaires cancéreuses ALT identifiées à ce jour. Pour valider la fonctionnalité d’ATRX dans ces lignées, j'ai évalué l'effet de l'expression ectopique d'un plasmide contenant le gène ATRXwt sur le phenotype ALT. Les caractéristiques du ALT ont été perturbées dans les lignées ATRX-négatives, mais aucun effet n'a été observé dans les lignées ATRX-positives. TOP3A favorise le mécanisme de réplication induite par les cassures en tant que membre du complexe BTR. L'effet de TOP3A sur l'ADN télomérique est peu exploré. Pour évaluer TOP3A comme élément critique du ALT dans les cellules ATRX positives, j'ai effectué des knock downs dans différents modèles de lignées cellulaires pour observer l'impact sur le ALT. Le knock down de TOP3A a entraîné une abolition ou une diminution d'au moins 50% des niveaux de cercles C dans les lignées cellulaires ATRX-positives. L'analyse TeSLA de la distribution de la taille individuelle du fragment télomérique a révélé l'apparition de télomères très courts <0,5kb dans les lignées cellulaires ALT positives à ATRX. Mes résultats confirment que la plupart des tumeurs ostéosarcomes ALT ne présentent pas d’altération d’ATRX, ce qui modifie le paradigme de l'inactivation d'ATRX dans les ALT. Nous avons identifié la surexpression de TOP3A et l'inactivation d'ATRX comme des caractéristiques mutuellement exclusives associées aux ALT dans les ostéosarcomes et validons fonctionnellement TOP3A comme régulateur du ALT dans ce contexte, soulignant ainsi l'intérêt potentiel du développement d'inhibiteurs de TOP3A dans les cancers ALT.

Telomeres maintenance is required for achieving immortality by neoplastic cells and can occur by up regulation of telomerase or through a recombination-based process known in 15% of tumours, called alternative lengthening of telomeres (ALT). Loss of function of the ATRX/DAXX/H3.3 axis is part of the one associated to ALT. Osteosarcomas are highly aggressive tumours known for exhibiting a high frequency of ALT. In contrast to some other tumour types, ATRX inactivation occurs in only 30% of ALT-positive osteosarcomas when almost no mutation in DAXX/H3.3 are found. This discrepancy between a high level of ALT and a low proportion of ATRX inactivation led me to the hypothesis that ATRX-mediated ALT inhibition could be overridden in certain conditions. The aim of this project was to identify these conditions by running multi-omics analyses on tumour from patients, and functionally validate best candidates implication in cell line models. I. ALT in paediatric osteosarcomas Starting with a cohort of paediatric patients with strictly localized diseases, naïve of any treatments. I identify 73% of the tumours with ALT phenotypic hallmarks, including C-Circles and Telomere length heterogeneity by FISH and TesLA. ALT-positivity was associated with worse outcomes in good responders to neoadjuvant chemotherapy compared to patients with ALT-negative tumours (4/9 events vs. 0/4 at 56.11 months of median follow up, respectively). II. Omics alterations associated with ALT in paediatric osteosarcomas TMM supervised NGS, and CGH analysis identified significant alterations in genes previously implicated in ALT (ATRX, XRCC5, SMARCAL1, DCLRE1B/Apollo, TOP3A, SP100). A global transcriptomic analysis further revealed mutual exclusivity between TOP3A overexpression and ATRX inactivation, assessed by immunohistochemistry, in ALT tumours. III. Identification of ATRX+, ALT+ cell lines Only 36% of ALT cancer cell lines exhibit ATRX, very consistently with the tumours data. To validate the functionality of ATRX in these cell lines, I assessed the effect of the ectopic expression of a plasmid containing ATRXwt gene on CCircles, APB and Telomere length heterogeneity. ALT hallmarks were disrupted in ATRX-negative cell lines, but no effect was observed in ATRX-positive ones. IV. TOP3A overexpression rescue ATRX ALT disruption in ATRX-negative ALT cell lines I have generated stable U2OS (ATRX-negative ALT cell line) that overexpressed TOP3A. After selection, transfection of ATRXwt plasmid no longer disrupted CCircles nor APB level. By associating FISH and IF, I observed TOP3A and PML bodies colocalization at telomeres both in ATRX-positive and ATRX-negative ALT cell lines. V. TOP3A knock-down disrupts ALT phenotype, and increases telomeric DNA damage TOP3A favours the mechanism of break-induced replication as part of the BTR complex. Effect of TOP3A on telomeric DNA is only sparely explored. To try to assess if TOP3A is a critical driver of ALT mechanism in ATRX positive cells, I performed knock downs in different cell lines models (17 cancer cell lines and 4 immortalized fibroblast cell lines) to observe the impact on ALT halmarlks. TOP3A knock down resulted in an abolition or at least 50% diminution of C-circles levels in ATRX-positive cell lines. Inhibition of TOP3A expression was also responsible for an increase in telomeric induce foci (TIF) in all cell lines. TeSLA analysis of the distribution of the individual size of telomeric fragment revealed appearance of very short telomeres <0.5kb in ATRX-positive ALT cell lines. My results support that most of ALT osteosarcomas tumours harbor wild type ATRX expression, shifting the paradigm of ATRX inactivation in ALT. We identify TOP3A overexpression and ATRX inactivation as mutually exclusive ALT-associated features in osteosarcomas and functionally validated TOP3A as an ALT regulator in this setting, thereby emphasizing the potential interest of TOP3A inhibitors development in ALT cancers.