Ecole Doctorale

Sciences de la Vie et de la Santé

Spécialité

Biologie-Santé - Spécialité Génétique

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

recombinaison,génétique moléculaire,levure,réplication induite par la rupture,instabilité du génome,

Keywords

recombination,molecular genetics,yeast,break-induced replication,genome instability,

Titre de thèse

Aspects de la régulation de la réparation de l'ADN par réplication induite par une seule extrémité de la molécule
Aspects of Break-Induced Replication (BIR) regulation

Date

Mardi 28 Septembre 2021 à 14:00

Adresse

27 Bd Leï Roure, CS 30059 13273 Marseille Cedex 09 Bibliothèque CRCM

Jury

Directeur de these M. Bertrand LLORENTE Centre de Recherche de Cancérologie de Marseille
Rapporteur Mme Sarah LAMBERT Institut Curie
Rapporteur M. Gérard MAZÓN Gustave Roussy UMR 9019, CNRS
Examinateur Mme Emmanuelle MARTINI Institut de biologie François Jacob
Examinateur M. Gilles FISCHER Institut de Biologie Paris Seine, Sorbonne Université
Examinateur Mme Marie-Noelle SIMON Centre de Recherche de Cancérologie de Marseille

Résumé de la thèse

L'ADN est constamment endommagé. Plusieurs mécanismes de réparation de l'ADN assurent l'intégrité du génome, ce qui est essentiel pour l’expression, la réplication et la transmission du génome de cellule en cellule. Parmi les lésions susceptibles d'endommager l'ADN, il y a les cassures double brin (DSB) qui sont considérées comme des lésions particulièrement délétères puisqu'une seule DSB non réparée suffit à entraîner la mort cellulaire. Les DSBs peuvent être réparées soit par simple ligature d'extrémités non homologues (NHEJ), soit par recombinaison homologue (HR) qui copie l’information génétique d'une molécule d’ADN homologue intacte pour réparer la lésion initiale. Le dysfonctionnement de l'une ou l’autre de ces deux voies conduit à une instabilité du génome, qui est une caractéristique de nombreux cancers. Ici, l'objectif est de mieux comprendre le mécanisme de réplication induite par cassure (BIR) et sa régulation. Le BIR est une sous-voie de la HR chez les eucaryotes qui vise à réparer les DSBs ne possédant qu’une seule extrémité, comme les cassures provenant des fourches de réplication de l'ADN cassées et des télomères érodés. Les premières étapes du BIR sont similaires à toute réaction canonique de HR. Elles impliquent un nucléofilament responsable de la recherche d'homologie dans le génome, de l'invasion ultérieure et de l'hybridation à une matrice, et de l'amorçage de la synthèse réparatrice de l'ADN. La spécificité du BIR est que l’étape de synthèse d'ADN est conservatrice et peut atteindre des centaines de kilobases jusqu'à atteindre une extrémité chromosomique, et entraîne automatiquement une perte d'hétérozygotie sur la région nouvellement répliquée. Le BIR repose sur l'hélicase Pif1 et sur Pol32, une sous-unité de Pol𝛿 qui n’est pas essentielle pour la réplication en phase S. Les longs fragments d’ADN synthétisés pendant le BIR impliquent de longs fragments d'ADN simple brin (ssDNA) qui sont hautement mutagènes. Ces propriétés font du BIR un mécanisme de réparation de l'ADN de dernier recours pour la cellule. À la recherche de facteurs agissant en cis régulant l'efficacité du BIR dans le long des bras chromosomiques de la levure, mon laboratoire d’accueil a constaté que l'efficacité du BIR est plus élevée à proximités des télomères. Pour mieux comprendre ce phénotype et d'identifier les mécanismes sous-jacents à un tel processus, J'ai étudié le BIR en utilisant un test de fragmentation chromosomique ciblant le bras droit du chromosome IV chez S. cerevisiae, et j'ai modifié différents facteurs cis et trans. J'ai trouvé que l’efficacités de BIR suit deux fonctions exponentielles de la longueur de l'ADN à synthétiser. Une telle découverte est en adéquation avec le mécanisme suspecté du BIR impliquant des cycles d'invasion, d'élongation et de dissociation. Il en résulte que l'efficacité du BIR est beaucoup plus élevée lorsque le BIR s'initie à proximité des extrémités du chromosome par rapport à des loci plus internes. J'ai démontré l'effet négatif de la longueur de l'ADN à répliquer sur l'efficacité du BIR en utilisant la translocation chromosomique médiée par CRISPR-Cas9 pour modifier la longueur de l'ADN à répliquer pendant le BIR. J'ai également constaté que la transcription convergente initiée en aval du site d'initiation du BIR, ainsi que la réplication et l'hétérochromatine, altèrent aussi l’efficacité du BIR. Enfin, j’ai montré que l'hélicase Srs2, qui est responsable de la régulation de la formation des intermédiaires toxiques pendant le BIR en raison des longues régions d'ADN simple brin exposées, favorise le BIR dans les cellules diploïdes. Srs2 favorise aussi le BIR dans un contexte haploïde, mais seulement quand il est initié proche des télomères. Dans l'ensemble, ce travail améliore notre compréhension du BIR et de sa régulation, ce qui pourrait avoir des implications futures.

Thesis resume

The DNA is constantly damaged. Several DNA repair mechanisms ensure genome integrity, which is essential for its expression, replication, and transmission from cell to cell. Among the lesions that damage the DNA are double strand breaks (DSBs) which are the most cytotoxic DNA lesions, since a single unrepaired DSB is enough to lead to cell death (Pâques and Haber, 1999). DSBs can be repaired either by simple end ligation through Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homologous Recombination (HR) that copies the genetic information from an intact homologous template to repair the initial lesion. Dysfunction of any of these two pathways leads to genome instability, which is a hallmark of numerous cancers (Moynahan and Jasin, 2010). Understanding the molecular basis of HR and its regulation is therefore essential for cancer research. Here, the objective is to gain insights into the Break-Induced Replication (BIR) mechanism and its regulation, a HR sub-pathway in Eukaryotes aiming to repair one-ended DSBs, similar to the breaks originating from broken DNA replication forks and from telomere erosion. The first stages of BIR are similar to any canonical HR reaction. They involve a nucleofilament responsible for the search of homology within the genome, the subsequent invasion and annealing to a template, and finally priming of DNA repair synthesis. The specificity of BIR is that its associated conservative DNA repair synthesis can reach hundreds of kilobases up to a chromosome end, and automatically yields loss of heterozygosity (LOH) over the newly replicated region. BIR relies on the Pif1 helicase and the non-essential Pol𝛿 subunit Pol32, the latter being dispensable for S phase replication. Last but not least, the long tracts of DNA repaired synthesis that characterize BIR involve long single strand DNA (ssDNA) tracts that are highly mutagenic. Overall, these properties make BIR a last resort DNA repair mechanism for the cell. In the search for cis-acting factors regulating BIR efficiency along yeast chromosome arms, previous work from my hosting lab found higher BIR efficiency at telomere proximity. With the aim to better understand this phenotype and to identify the mechanisms underlaying such a process, I studied BIR using a chromosome fragmentation assay targeting the right arm of the chromosome IV in S. cerevisiae and I modified different cis and trans factors. Remarkably, I found that the different BIR efficiencies observed follow two exponential functions of the length of DNA to synthesize. Such a finding correlates with the suspected BIR mechanism involving cycles of strand invasion, elongation, and dissociation. This results in BIR efficiency being much higher when BIR initiates close to chromosome ends compared to more internally loci. I eventually directly demonstrated the negative effect of the length of DNA to replicate on BIR efficiency using CRISPR-Cas9 mediated chromosome translocation to modify the length of DNA to replicate during BIR. In addition to the length of DNA to replicate, I also found that converging transcription initiated downstream the BIR initiation site, as well replication and heterochromatin impair BIR. Finally, I showed that the helicase Srs2, which is responsible to regulate toxic intermediates formed during BIR due to the exposed long ssDNA tails, promotes BIR in diploid cells, while only close to the telomeres in haploid cells. Overall, this work provides new insights into our understanding of BIR and its regulation, which could have future implications, particularly in human health.