Soutenance de thèse de Nicolas FLAUGNATTI

Dans l’environnement les bactéries ne vivent pas seules, elles coopèrent mais se mènent également une guerre pour l’acquisition des nutriments présents dans différentes niches écologiques. Le système de sécrétion de type VI (T6SS) est l’un des acteurs principaux dans cette guerre antimicrobienne. Il permet la sécrétion, directement dans les cellules compétitrices, d’effecteurs antibactériens. Ce système est retrouvé chez 25 % des bactéries à Gram négatif. En collaboration avec une équipe américaine nous avons montré que le T6SS est essentiel à la colonisation de la niche car il permet de cibler des espèces compétitrices afin de prendre leur place. Au laboratoire nous utilisons comme modèle d’étude la souche Escherichia coli entéro-agrégatif (EAEC). EAEC est un pathovar qui colonise le tractus intestinal de l’homme, notamment grâce à des propriétés d’agrégation, et cause des diarrhées sévères et persistantes chez les nourrissons, les jeunes enfants et les personnes immunodéprimées. Cette souche est responsable de l’épidémie survenue en Allemagne en 2011 ayant tué cinquante patients. Le T6SS est une structure macromoléculaire comprenant : un complexe membranaire (MC) ancré à la membrane qui recrute et assemble une structure tubulaire contractile. Le tube interne est enfermé dans un fourreau contractile. Au sommet de cette structure se trouve la pointe perforatrice du système formée par un trimère de la protéine VgrG. La queue contractile s’assemble dans une conformation étendue. Au contact d’une bactérie cible le fourreau contractile va subir un changement de conformation aboutissant à sa contraction, ce qui va propulser le tube interne et la pointe perforatrice dans la cellule cible. Les toxines sont sécrétées directement dans la proie en interagissant avec les protéines formant le tube ou la pointe du système. L’objectif de ma thèse a été d’identifier les toxines sécrétées par le T6SS d’EAEC et comprendre leur mécanisme de sécrétion. Nous avons caractérisé Tle1, un effecteur responsable de l’activité antibactérienne du T6SS-1 d’EAEC. Tle1 possède une activité périplasmique de type phospholipase A1 (PLA1). La cellule productrice se protège contre l’activité toxique de cet effecteur en produisant une protéine d’immunité, Tli1 qui est une lipoprotéine de membrane externe. Nous avons montré que Tli1 inhibe Tle1 via une interaction directe avec une affinité de l’ordre du nanomolaire. En utilisant différentes techniques d’études d’interaction protéine-protéine nous avons montré que Tle1 interagit directement avec l’extension C-terminale de VgrG. Cette interaction permet de sécréter Tle1 directement dans les bactéries cibles. Notre laboratoire a récemment obtenu la structure du MC en utilisant la microscopie électronique couplée à la coloration négative (NS-EM). Ce complexe de 1. 7 MDa traverse l’enveloppe de la bactérie et forme un canal permettant le passage du tube interne. Ce canal pourrait également accueillir le complexe VgrG-Tle1. Nous avons utilisé des approches multidisciplinaires pour obtenir des informations détaillées sur le chargement de l’effecteur sur la pointe du T6SS. Nous avons mis au point une stratégie pour purifier le complexe VgrG-Tle1 en utilisant des étiquettes d’affinité. En utilisant la NS-EM nous avons obtenu la structure du complexe avec une résolution de 23 Å. Nous avons ensuite utilisé une technique de pontage chimique couplé à de la spectrométrie de masse pour cartographier les contacts établis entre les deux protéines au sein du complexe. Nos données montrent que Tle1 présente un domaine N-terminal nécessaire à l’interaction avec le domaine C-terminal de la pointe VgrG. Ce domaine est également nécessaire pour le transport in vivo de Tle1 dans les cellules proies. De manière intéressante nous avons démontré que Tle1 est inhibée au sein du complexe VgrG-Tle1. Ce résultat suggère que l’effecteur doit se dissocier de la pointe pour exercer son activité toxique une fois sécrété dans la cellule cible.

Bacteria do not live alone in their environment; they cooperate but also compete for niches and resources. The Type VI secretion system (T6SS) is one of the key players in the bacterial warfare by delivering anti-bacterial effectors directly into competitor cells. This system found in approximatively 25 % of Gram negative bacteria. In collaboration with an american group we showed that T6SS is essential to clear and colonize the ecological niche by killing competitors. In our laboratory, we use the enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) as a model bacterium. EAEC is an emerging pathotype that aggregates and colonizes the intestinal tract and causes severe and persistent diarrhoea in infants, young children or immunocompromised individuals. EAEC was responsible for the German outbreak that killed fifty patients in 2011. The T6SS is a macromolecular structure: A membrane complex (MC) anchored in the envelope recruits an assembly platform for a contractile tail structure. The tail is a tube wrapped by a sheath and topped by a needle spike called VgrG. The tail assembles in an elongated conformation. Upon contact with a target cell, the contraction of the sheath propels the inner tube and the spike toward target cells. By interacting with the tube or the spike proteins, the toxins are delivered directly into prey cells. The goal of my PhD work was to identify T6SS toxins and to understand how they are selected by the EAEC T6SS. We have characterized Tle1, an antibacterial effector responsible for the antibacterial activity of EAEC T6SS. Tle1 is a periplasmic-acting toxin with phospholipase A1 (PLA1) activity. Self- protection of the producing cell is assured by an outer membrane lipoprotein, Tli1, which binds Tle1 with nanomolar affinity and inhibits its PLA1 activity. Using various protein-protein interaction techniques, we further showed that Tle1 interacts directly with the C-terminal extension domain of VgrG to allow subsequent delivery into target bacteria. Our laboratory recently obtained the structure of the MC by electron microscopy after negative staining (NS-EM). This 1.7-MDa complex crosses the cell envelope and forms a channel for the tube during sheath contraction, as well as a cavity that may accommodate the VgrG-Tle1 complex. We used a multidisciplinary approach to provide detailed information on effector loading of the T6SS VgrG spike. We defined a rationalized affinity tag-position strategy to purify the VgrG-Tle1 complex. We succeeded to obtain a 3D model of the VgrG-Tle1 complex at 23 Å resolution by NS-EM. We then used a mass spectrometry after cross-linking approach to map the protein/protein contacts at the amino-acids level. Our data highlights that a specific N terminal sequence within Tle1 effector is required for binding to the C-terminal domain of the VgrG spike for delivery. Interestingly we also demonstrated that binding of Tle1 to VgrG inhibits its activity, suggesting for the first time that a cargo effector should be dissociated in the target cell.