Soutenance de thèse de Guillaume GIROUSSENS

L'intensité d'un champ électromagnétique de longueur d'onde λ enregistrée par une caméra ne peut présenter de fréquences spatiales plus grandes que 2/λ. Cette limite fondamentale provient du filtrage passe-bas imposé par la propagation des ondes et ne peut être évitée. Ainsi, la résolution des meilleurs microscopes optiques classiques est de l'ordre de 200 nm. Cependant, de nombreuses applications, en particulier dans le domaine de la biologie, bénéficieraient de techniques de microscopie optique présentant une meilleure résolution. La question est alors, comment extraire des informations fréquentielles sur l'échantillon au-delà de 2/λ à partir d'images forcément limitées en fréquence à 2/λ. Une solution largement répandue est de combiner les diverses informations sur l'échantillon contenues dans des images acquises sous différentes illuminations. Ainsi, la méthode Random Illumination Microscopy (RIM) permet de reconstruire une image de l'échantillon deux fois plus résolue que celle d'un microscope standard à partir d'une centaine d'images obtenues sous différents éclairements de speckle inconnus. L'intérêt principal de cette méthode est qu'elle se passe de l'estimation a posteriori des éclairements lors de la reconstruction. Pour cela, RIM se base sur la résolution d'un problème inverse non linéaire de type variance matching, et trouve l'objet dont la variance modèle correspond au mieux à la variance des images mesurées. L'objectif de ma thèse est l'extension de RIM à la reconstruction d'échantillons tridimensionnels (3D). Cette extension requiert d'améliorer les méthodes numériques, afin de pouvoir traiter des données bien plus nombreuses, et d'étudier les montages optiques, pour préciser les modalités d'acquisition des images tridimensionnelles. Pour cela, j'ai développé deux nouveaux schémas d'inversion pour la reconstruction RIM, basés sur l'écart-type plutôt que la variance des données. Le premier schéma est un algorithme approché. Il propose une déconvolution linéaire de l'écart-type par un filtre adapté. Cette déconvolution permet des gains de résolution de l'ordre de 50%, avec un temps de calcul compatible à l'imagerie temps réel. Le deuxième schéma de reconstruction estime de manière itérative la densité de fluorescence de façon à minimiser l'erreur entre l'écart-type expérimental et l'écart-type modèle. En introduisant un préconditionneur adapté, cette inversion itérative basée sur l'écart-type s'est avérée au moins 20 fois plus rapide que la méthode itérative de variance matching précédemment développée, tout en conservant le même niveau de super-résolution. J'ai ensuite étudié les différentes modalités d'acquisition d'images 3D couramment utilisées en microscopie optique (translation de l'échantillon ou translation du plan focal objet par remote focusing). J'ai montré que les images 3D réalisées avec un système de remote focusing sont parfaitement adaptées à l'extension de la théorie RIM en 3D. Elles permettent d'obtenir des reconstructions avec des résolutions axiale et transverse optimales. La méthode est également applicable avec des acquisitions obtenues en translatant l'échantillon, plus simples à mettre en œuvre expérimentalement, au prix d'une faible dégradation de la qualité de l'image reconstruite. La dernière contribution de cette thèse sort du cadre de la microscopie de fluorescence, et s'intéresse à l'applicabilité de la méthode RIM pour l'imagerie cohérente. Dans ce cas, on peut montrer qu'une image d'intensité est équivalente à une variance asymptotique d'images sous éclairements de speckle. Dans ce cas, la méthode RIM est équivalente à une méthode de Ptychographie de Fourier Multiplexée, qui permet simultanément une augmentation de la résolution ainsi que la récupération de l'information de phase. Le formalisme de RIM apporte cependant une nouvelle vision sur la Ptychographie de Fourier puisqu'il permet de réduire le nombre d'images nécessaires à la reconstruction.

The Random Illumination Microscopy (RIM) method, introduced in 2019 for fluorescence microscopy, reconstructs an image of the sample with twice the resolution of that obtained with a standard microscope, from around a hundred images obtained under different illuminations of unknown intensity. The main advantage of this method is that it dispenses with the need for a posteriori estimation of illuminances during reconstruction. To achieve this, RIM is based on the resolution of a nonlinear inverse problem of the variance matching type. In practice, this means trying to find the object whose theoretical variance best matches the variance of the recorded images. RIM has been developed within the simplified framework of a two-dimensional (2D) sample, where only fluorescence at the focal plane contributes to the useful signal, and fluorescence from out-of-focus structures is modeled as background noise. The aim of my thesis is to extend RIM to the reconstruction of three-dimensional (3D) samples. This requires improvements in numerical methods, to be able to process much more data, and the study of optical setups, in order to specify the methods used to acquire three-dimensional images. To this end, I have developed two new inversion schemes for RIM reconstruction, based on the standard deviation rather than the variance of the data. The first scheme is an approximate algorithm. It proposes a linear deconvolution of standard deviation by a suitable filter. This deconvolution enables resolution gains of the order of 50% on dense objects, with a computation time compatible with real-time reconstruction. The second reconstruction scheme iteratively estimates the fluorescence density to minimize the error between the experimental standard deviation and the model standard deviation. By introducing a suitable preconditioner, this standard deviation-based iterative inversion proved to be at least 20 times faster than the previously developed iterative variance matching method, while maintaining the same level of super-resolution. I then studied the different 3D acquisition modalities commonly used in optical microscopy (sample translation or translation of the object focal plane by remote focusing). I have shown that 3D images produced with a remote focusing are perfectly suited to extend RIM theory into 3D. They enable us to obtain reconstructions with optimal axial and transverse resolutions. This approach is particularly interesting to applications that suffer from a limited photon budget. I have also shown that acquisitions obtained by translating the sample, which are simpler to implement experimentally, only slightly degrade the quality of the reconstructed image. The final contribution of this thesis goes beyond fluorescence microscopy, and looks at the applicability of the RIM method to coherent imaging. In this case, it can be shown that a standard intensity image acquired in brightfield or darkfield, is directly equivalent to an asymptotic variance of images under speckle illuminations. We then show that the RIM method is equivalent to a Multiplexed Fourier Ptychography method, which simultaneously increases resolution and recovers phase information. The RIM formalism brings a new perspective to Fourier Ptychography, as it reduces the number of images required for reconstruction.