Soutenance de thèse de Qiujuan SHEN

Cette étude vise à explorer les processus de transfert d’électrons (ET) au sein d’une Multi Copper Oxidase (MCO) fongique à haut potentiel redox (laccase LAC3), en se concentrant sur la compréhension des facteurs influençant l’ET, y compris le potentiel redox, l’inhibition de l’enzyme, et la configuration des sites métallés de l’enzyme (mononucléaire de CuII ou T1 et trinucléaire de CuII ou TNC). Divers variants de LAC3 (mutant de la sphère de coordination du T1 - F463M, mutant dépourvu de T1 - T1, lysine de surface - UNIKs) ont été utilisés pour étudier ces facteurs en détail. La caractérisation initiale de LAC3 a révélé que l’étape limitante du cycle catalytique de LAC3 était l’ET intramoléculaire, influencée par le potentiel redox entre le T1 et le TNC. Pour la première fois, LAC3 a montré une activité élevée de réduction de l’oxygène même lorsqu’elle est simplement adsorbée sur des MWCNTs, ouvrant la voie à une caractérisation électrochimique approfondie. Des études ultérieures sur les variants F463M et T1 ont permis de mettre en évidence le rôle critique du centre T1 dans la catalyse. La diminution du potentiel redox du T1 a amélioré de manière significative la réduction électrocatalytique de l’oxygène et a accru la tolérance de l’enzyme aux inhibiteurs chez le variant F463M. Profitant d’une inhibition contrôlée, des signaux non catalytiques ont pu être observés dans les différentes enzymes. La comparaison de ces signaux permet de proposer une attribution des signatures redox du T2 et du T3 et, potentiellement, d’introduire une méthode novatrice pour déterminer la charge enzymatique effective à la surface des électrodes. Enfin, l’exploration de l’influence de l’orientation de l’enzyme à la surface de l’électrode grâce à l’utilisation d’hybrides spécifiques a montré que les électrons pouvaient être directement injectés dans le TNC, ce qui améliore la réduction de l’O₂ en catalyse hétérogène. Ce travail offre une compréhension globale du transfert d’électrons dans la laccase, présente de nouvelles méthodologies pour caractériser le potentiel enzymatique et souligne l’importance de l’orientation de l’enzyme dans l’optimisation des performances catalytiques. Les résultats offrent des perspectives précieuses pour le développement des biocathodes et d’autres applications impliquant des réactions catalysées par des MCO.

This study aims to investigate electron transfer (ET) processes within a high-redox potential fungal Multi Copper Oxidase (laccase LAC3), focusing on understanding the factors influencing ET, including redox potential, enzyme inhibition, and the configuration of the enzyme active metaled sites (mononuclear CuII or T1 and trinuclear CuII or TNC). Various LAC3 variants (T1 coordination sphere mutant - F463M, mutant devoid of T1 -T1, single surface lysine - UNIKs) were engineered to explore these factors in detail. Preliminary studies on LAC3 revealed that the rate-limiting step in the catalytic cycle was intramolecular ET, which is influenced by the redox potential difference between T1 and TNC. As a novel finding in this study, LAC3 exhibited high oxygen reduction activity when simply adsorbed on MWCNTs paving the way for a thorough electrochemical characterization. Subsequent studies on the F463M and T1variants highlighted the critical role of T1 center during catalysis. Lowering the T1 redox potential significantly enhanced the electrocatalytic oxygen reduction and significantly improved the enzyme’s tolerance to inhibitors in the F463M variant. Taking advantage of a controlled inhibition, non-turnover signals could be observed in the different enzymes. Comparison of these signals allows us to propose an assignment of the T2 and T3 redox signatures and, potentially, to introduce a novel method for determining effective enzyme loading on electrode surfaces. Finally, exploring the influence of enzyme orientation on the electrode through the use of site-specific hybrids demonstrated that electrons can be directly injected into TNC, enhancing O₂ reduction in heterogeneous catalysis. This work provides a comprehensive understanding of ET in laccase, presents new methodologies for characterizing enzyme potential and highlights the importance of enzyme orientation in optimizing catalytic performance. The results obtained offer valuable insights for advancing the development of biocathodes and other applications involving enzyme-catalyzed reactions.