Soutenance de thèse de Zakaria MARMRI

Les ZMWs (Zero Mode Wave Guide) sont des nanostructures constituées par des trous nanométrique dans une couche métallique déposée sur un substrat transparent. Leurs propriétés optiques d’exaltation ou de confinement optique a été fortement exploiter pour l’observation de molécules uniques. Parmi les applications des ZMW, le séquençage d’ADN en molécule unique s’est révélée être une application industrielle majeure. Cette technologie est basée sur l’observation simultanée et en temps réel de centaines de milliers de polymérases travaillant chacune à la synthèse d’une molécule d’ADN et immobilisées chacune dans un ZMW d’aluminium. Notre travail de thèse à consister à mettre au point la fabrication de ZMW dans une couche de chrome pour permettre leur chauffage par photothermie et à étudier la fonctionnalisation de ces ZMW de chrome dans le but d’immobiliser des complexes ADN-polymérase fonctionnels. Nous avons étudié la fabrication de ZMW par lithographie e-beam et nous montrons qu’une des problématiques de cette technique pour obtenir des ZMW de diamètre inférieur à 100nm provient du manque d’adhésion des résines de lithographie sur le substrat. Différentes stratégies de passivation et bio-fonctionnalisation des ZMW ont été explorées pour permettre une fonctionnalisation différentiée des parois de chrome du ZMW et de son fond de verre. Nous avons en particulier établi la faisabilité de greffer directement l’ADN au verre via une liaison phosphate introduite par une modification phosphate préalable d’une de ses extrémités. Des études d’élongation de l’ADN par la Therminator polymérase au sein des ZMW ont été réalisées sans succès mais nos observations ont permis de révéler certaines problématiques à résoudre liées à l’observation de la polymérisation de l’ADN dans les ZMW.

ZMWs (Zero Mode Wave Guide) are nanostructures formed by nanometric holes in a metallic layer deposited on a transparent substrate. Their optical properties of exaltation or optical confinement has been strongly exploited for the observation of single molecules. Among the applications of ZMWs, single molecule DNA sequencing has emerged as a major industrial application. This technology is based on the simultaneous and real time observation of hundreds of thousands of polymerases each working on the synthesis of a DNA molecule and each immobilized in an aluminum ZMW. Our thesis work consisted in developing the fabrication of ZMWs in a chromium layer to allow their heating by photo-thermia and to study the functionalization of these chromium ZMWs in order to immobilize functional DNA-polymerase complexes. We have studied the fabrication of ZMWs by e-beam lithography and show that one of the problems of this technique to obtain ZMWs of diameter lower than 100nm comes from the lack of adhesion of the lithography resins on the substrate. Different strategies of passivation and bio-functionalization of ZMWs have been explored to allow a differentiated functionalization of the chromium walls of the ZMW and of its glass background. In particular, we have established the feasibility of directly grafting DNA to the glass via a phosphate bond introduced by a prior phosphate modification of one of its ends. Studies of DNA elongation by Therminator polymerase within ZMWs have been unsuccessful, but our observations have revealed some issues to be resolved related to the observation of DNA polymerization in ZMWs.