Soutenance de thèse de Caroline MERCIER

STOP1 (SENSITIVE TO PROTON RHIZOTOXICITY 1) est un facteur de transcription majeur de la tolérance des plantes à plusieurs contraintes environnementales néfastes à leur croissance. Nous avons étudié le rôle de STOP1 pour l’expression du gène ALMT1 (ACTIVATED MALATE TRANSPORTER 1) - dont l’expression nécessite STOP1 - et pour la croissance racinaire des plantules d’Arabidopsis thaliana en fonction du pH et des teneurs en phosphate, fer (Fe2/3+) et aluminium (Al3+) du milieu de culture gélosé. Nous avons montré chez des plantules poussant sur un milieu carencé en phosphate, que l’aluminium stimule l’expression d’ALMT1 à de faibles concentrations (> ou = 2 µM) et à des pH relativement élevés (< 6). Cette stimulation est aussi activée par le fer, indépendamment ou en synergie avec l’aluminium. En revanche, bien que favorisant cette expression, la carence phosphatée en elle-même n’est pas suffisante, ni nécessaire à cette stimulation. Par contraste, le pH et la teneur en Pi, Fe et Al du milieu de culture n’influencent pas la transcription du gène STOP1, suggérant une régulation post-transcriptionnelle de son activité. En effet, à l’aide de plantules exprimant la fusion traductionnelle GFP-STOP1 (GREEN FLUORESCENT PROTEIN), nous avons montré par microscopie confocale que l’accumulation nucléaire de STOP1 observée en condition de carence phosphatée, nécessite un pH acide (< 6) et du fer ou de l’aluminium. De plus, l’inhibition pharmacologique du protéasome augmente l’abondance de STOP1 au noyau, montrant que la stabilité de la protéine est une étape cruciale de sa régulation. Nous avons ensuite montré que des mutations fracturant du gène SIZ1, codant une SUMO (SMALL UBIQUITIN-RELATED MODIFIER) ligase, augmentent l’abondance de la protéine STOP1 et l’expression d’ALMT1 dans l’apex de la racine. Ce résultat suggère que SIZ1 déstabilise STOP1 par sumoylation. Toutefois, en expression hétérologue chez E.coli suivie de Western-blots nous n’avons pas détecté de sumoylation de STOP1. Enfin, pour caractériser finement l’activité transcriptionnelle de STOP1, nous avons créé puis introduit dans Arabidopsis, un gène rapporteur combinant pALMT1 et la technologie MS2/MCP (MS2 coat protein). Dans des conditions de culture stimulant l’activité de STOP1, nous avons observé in vivo des points de fluorescence GFP correspondant aux sites de transcription de pALMT1::MS2 et des points plus petits et plus nombreux correspondant à des transcrits isolés ALMT1::MS2. Cette interprétation a été validée sur ces lignées avec des sondes FISH (fluorescence in situ hybridization) spécifiques des transcrits MS2, ainsi que chez des plantules non transgéniques avec des sondes FISH spécifiques des ARNm ALMT1. Nous concluons donc que ce marqueur permet d’observer in vivo la transcription dépendante de STOP1. En résumé, notre travail montre que la stabilité de la protéine STOP1 est une étape clef de sa régulation par le fer, l’aluminium et le pH, et dans laquelle la sumo-ligase SIZ1 intervient. Par ailleurs, nous avons mis au point un marqueur transcriptionnel d’ALMT1 visualisable en temps réel.

STOP1 (SENSITIVE TO PROTON RHIZOTOXICITY 1) is a major transcription factor for plant tolerance to several environmental stresses that are harmful for plant growth. We studied the role of STOP1 for the expression of the ALMT1 (ACTIVATED MALATE TRANSPORTER 1) gene - whose expression requires STOP1 - and for the root growth of Arabidopsis thaliana seedlings as a function of pH and phosphate, iron (Fe2/3+) and aluminum (Al3+) contents of the agar culture medium. We showed that in seedlings grown on phosphate-deficient medium, aluminum stimulates ALMT1 expression at low concentrations (> ou = 2 µM) and relatively high pH (< 6). This stimulation is also activated by iron, either independently or synergistically with aluminum. However, although promoting this expression, phosphate deficiency by itself is not sufficient or necessary for this stimulation. In contrast, the pH, Pi, Fe and Al content of the culture medium do not influence the transcription of the STOP1 gene, suggesting a post-transcriptional regulation of its activity. Indeed, using seedlings expressing the GFP-STOP1 (GREEN FLUORESCENT PROTEIN) translational fusion, we have shown by confocal microscopy that the nuclear accumulation of STOP1 observed under phosphate deficiency conditions requires an acidic pH (< 6) and iron or aluminum. Moreover, inhibition of the proteasome increases the abundance of STOP1 in the nucleus, showing that the stability of the protein is a crucial step in its regulation. We then showed that fracturing mutations in the SIZ1 gene, encoding a SUMO (SMALL UBIQUITIN-RELATED MODIFIER) ligase, increase STOP1 protein abundance and ALMT1 expression in the root apex. This result suggests that SIZ1 destabilizes STOP1 by sumoylation. However, in heterologous expression in E.coli followed by Western blots, sumoylation of STOP1 was not detected. Finally, to characterize the transcriptional activity of STOP1, we created and introduced in Arabidopsis a reporter gene combining pALMT1 and MS2/MCP (MS2 coat protein) technology. Under culture conditions stimulating STOP1 activity, we observed in vivo GFP fluorescence spots corresponding to pALMT1::MS2 transcription sites and numerous smaller spots corresponding to isolated ALMT1::MS2 transcripts. This interpretation was validated in these lines with fluorescence in situ hybridization (FISH) probes specific for MS2 transcripts, as well as in non-transgenic seedlings with probes specific for the endogenous ALMT1. We therefore conclude that this reporter allows us to observe STOP1-dependent transcription in vivo. In summary, our work shows that the stability of the STOP1 protein is a key step in its regulation by iron, aluminum and pH, and in which the sumo-ligase SIZ1 is involved. Furthermore, we have developed a transcriptional reporter of ALMT1 that can be visualized in real time.