Ecole Doctorale

Sciences de la Vie et de la Santé

Spécialité

Biologie-Santé - Spécialité Oncologie

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

cancer du sein,cellules souches cancéreuses,stress réplicatif,recombinaison homologue,RAD51,essai préclinique

Keywords

breast cancer,cancer stem cells,replication stress,homlogous recombination,RAD51,preclinical trial

Titre de thèse

Cellules souches Cancéreuses et résistance thérapeutique du cancer du sein: Ciblage des cellules souches cancéreuses mammaires par l'inhibition de la réponse au stress réplicatif
Cancer stem cell and therapeutic resistance in breast cancer: Targeting breast cancer by sabotaging the response to DNA replication stress

Date

Friday 14 December 2018

Adresse

Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille (CRCM) Inserm 1068 - CNRS 7258 - Aix-Marseille Université 105 - Institut Paoli Calmettes 27 bd Leï Roure, CS 30059, 13273 Marseille Cedex 09 France Salle de conférence IPC2

Jury

CoDirecteur de these M. Christophe GINESTIER Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille
CoDirecteur de these Mme Emmanuelle CHARAFE-JAUFFRET Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille
Rapporteur M. Raphaël RODRIGUEZ Institut Curie
Rapporteur M. Domenico MAIORANO Institut de génétique humaine
Examinateur Mme Denise ARAGNOL Université Aix Marseille
Examinateur Mme Nina RADOSEVIC ROBIN Centre Jean Perrin

Résumé de la thèse

Les tumeurs mammaires sont connues pour présenter une grande hétérogénéité intratumorale qui contribue à l’échec thérapeutique et à la progression de la maladie. L’origine de dette hétérogénéité s’explique principalement par l’organisation hiérarchique des tissus tumoraux où plusieurs sous-populations de cellules souches de cancer du sein (bCSC) sont capables de s’auto-renouveler et de maintenir l’architecture oligoclonale de la tumeur. Dans la mesure où les bCSC stimulent la croissance tumorale, résistent aux thérapies conventionnelles et initient le développement des métastases, il est indispensable de développer des thérapies spécifiques ciblant ces cellules. L’élaboration d’une telle stratégie nécessite la compréhension des propriétés moléculaires intrinsèques des bCSC. Pour mieux comprendre leur biologie, nous avons isolé les bCSC de différentes xénogreffes dérivées de tumeurs de patientes (PDX) et établit leurs profil d’expression génique. Nous avons identifié un programme transcriptionnel pouvant être impliqué dans la réduction du stress réplicatif (SR) des bCSC (surexpression des gènes impliqués dans le métabolisme des dNTP et de la recombinaison homologue). Cette fonction cellulaire clé pourrait être héritée des cellules souches normales qui limitent leur SR pour préserver la stabilité du génome et éviter la défaillance des organes, le vieillissement prématuré ou la formation de cancer. Dans le contexte tumoral un faible SR peut favoriser la résistance à la chimio-et radiothérapie. Pour tester cette hypothèse nous avons d’abord mesuré le SR dans les bCSC et dans les non-bCSC. Les non-bCSC présentent une augmentation du nombre d’origines et de fourches de réplication bloquées tandis que les bCSC présentent un plus faible SR associé à une augmentation de l’expression de la protéine RAD51, un acteur clé de la recombinaison homologue (HR).Pour vérifier que les bCSC résistent mieux au SR, nous avons traité les cellules avec l’APPO, un dérivé clikable du cisplatin. Cette chimiothérapie utilisé dans les cancers du sein agressifs conduit à la formation de ponts entre les bases de l’ADN qui constituent des obstacles pour la fourche de réplication et augmentent le SR. L’utilisation de cette sonde clikable a permis la détection des lésions de l’ADN (AND-Pt) directement dans la cellule et a révélé que les bCSC éliminent plus rapidement les adduits de cisplatin que les non-bCSC notamment grâce au recrutement plus rapide de RAD51. Nos résultats indiquent que RAD51 joue un rôle majeur dans la régulation du SR des bCSC puisque son inhibition avec un shRNA ou avec un inhibiteur pharmaceutique, le BO2, diminue le pool de bCSC en augmentant leur SR. Pour exploiter le SR comme stratégie thérapeutique permettant de sensibiliser les bCSC à des agents génotoxique, nous avons réalisé un essai préclinique sur des PDX, en combinant le BO2 avec du cisplatin. Nos résultats indiquent que le BO2 empêche l’expansion de la population tumorigène induite par la chimiothérapie. Ces travaux identifient le SR comme un puissant moteur de la maintenance des bCSC et mettent en évidence la HR comme cible potentielle pour les traitements anti-BCSC.

Thesis resume

Breast tumors are known to present a major intratumoral heterogeneity that contributes to therapy failure and disease progression. The origin of this cellular heterogeneity is mainly explained by a hierarchical organization of tumor tissues where several subpopulations of self-renewing breast cancer stem cells (bCSCs) sustain the long-term oligoclonal maintenance of the neoplasm. bCSCs drive tumor growth, resist to conventional therapies and initiate metastasis development. Thus, developing bCSC-targeting therapies is becoming a major challenge requiring the understanding of the unique molecular circuitry of bCSC as compared to non-bCSC. To better understand the biology of these cells, we isolated bCSCs from different patient–derived xenografts (PDXs), derived fom breast tumors, and established their gene expression profiles. We identified a bCSC core transcriptional program that may be implicated in the reduction of the replicative stress in CSC (overexpression of genes implicated in dNTP metabolism and homologous recombination). This key cellular function might be inherited from normal epithelial stem cells that limit replication stress to preserve genome stability and avoid organ failure, premature aging, or cancer formation. In a tumoral context, a low replicative stress may promote bCSC chemo- and radio-resistance. To test this hypothesis, we first measured the replication stress in bCSC and non-bCSC. Non-bCSC presented an increase firing of replication origins and stalled forks whereas bCSC presented a low replication stress associated with an increase of RAD51, a key factor oh homologous recombination (HR). To check if bCSC are more resistant to RS than non-bCSC, we treated cells with cisplatin azide-containing derivative. This chimiotherapy is frequently used to treat aggressive breast cancer. This drug leads to the formation of interstrand crosslinks between bases. These crosslinks form a barrier against DNA replication and delay the progression of replication forks enhancing replication stress. The use of this clickable probe allows the in cellulo detection of DNA-Pt lesions and reveals that bCSC eliminate cisplatin more quickly than non-bCSC thanks to RAD51 recruitment. Our results show that RAD51 plays a major role in SR regulation of bCSC and this inhibition by shRNA or pharmacological inhibitor decrease the bCSC pool in increasing SR. Exploiting replication stress appear as a valid therapeutic strategy to make tumor cells more susceptible to cell death caused by genotoxic agents than most normal cells. We realized a preclinical assay in PDX, the combination therapy BO2/cisplatin show that BO2 treatment prevent the bCSC expansion cisplatin-induced, suggesting a sensitization of the bCSC to the chemotherapy. Our results identify replication stress as a potent driver of bCSC maintenance and highlights HR as potential targets for anti-bCSC therapy.