Ecole Doctorale

SCIENCES CHIMIQUES - Marseille

Spécialité

Sciences Chimiques

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

bioélectrochimie,in-situ microscopie de fluorescence,métalloenzymes,bilirubine oydase,

Keywords

enzyme electrochemistry,in-situ fluorescence microscopy,metalloenzymes,bilirubin oxidase,

Titre de thèse

Etude de la catalyse enzymatique par couplage microscopie-électrochimie : application aux biopiles à combustible H2/O2
Characterization of enzymatic catalysis by microscopy and electrochemistry: application to H2/O2 bio-fuel cells

Date

Wednesday 7 December 2022 à 14:00

Adresse

CNRS, 31 Chem. Joseph Aiguier, 13009 Marseille Amphithéâtre P. DESNUELLE

Jury

Directeur de these Mme Elisabeth LOJOU CNRS UMR 7281 Laboratoire de Bioenergetique et d'Ingenierie des Protéines (BIP)
Co-encadrant de these Mme Anne DE POULPIQUET CNRS UMR 7281 Laboratoire de Bioenergetique et d'Ingenierie des Protéines (BIP), Aix-Marseille Université
Rapporteur M. Thomas DONEUX Chemistry of Surfaces, Interfaces and Nanomaterials (ChemSIN), Université libre de Bruxelles
Rapporteur Mme Sabine SZUNERITS UMR 8520 - INSTITUT D'ELECTRONIQUE, DE MICROELECTRONIQUE ET DE NANOTECHNOLOGIE, Université de Lille
Examinateur M. Laurent BOUFFIER Institut des Sciences Moléculaires - UMR 5255 CNRS ,Université de Bordeaux - ENSCBP
Examinateur M. Olivier MARGEAT UMR 7325 – CINaM (Centre Interdisciplinaire de Nanoscience de Marseille), Aix-Marseille Université

Résumé de la thèse

Au milieu de la crise énergétique mondiale, les biopiles enzymatiques, qui utilisent des biocatalyseurs (enzymes) pour convertir l'énergie chimique en électricité, se présentent comme l'une des ressources énergétiques alternatives et propres les plus prometteuses. Les réactions catalytiques impliquant des enzymes redox peuvent être caractérisées en utilisant des méthodes électrochimiques. Cependant, l'immobilisation fonctionnelle de ces enzymes sur une électrode pour une catalyse efficace suscite encore de nombreux défis. Ainsi, une mesure électrochimique intègre les courants sur toute la surface de l'électrode, et ne donne que des informations globales. Afin d’accéder à une résolution spatiale, il est donc nécessaire de coupler l'électrochimie à d’autres techniques de surface. En particulier, la microscopie confocale à fluorescence couplée à l'électrochimie permet de sonder les hétérogénéités locales ainsi que la couche de diffusion formée à l'électrode lors de la catalyse. Dans cette thèse, le couplage de la microscopie de fluorescence confocale à balayage laser avec l'électrochimie a été mis en place pour la caractérisation de la catalyse électro-enzymatique. La principale réaction étudiée était la réaction de réduction de l'oxygène catalysée par la bilirubine oxydase de Myrothecium verrucaria (MvBOD). Des (micro)électrodes en graphite et en or ont été conçues spécialement pour le montage électrochimie-microscopie. L'adsorption de la MvBOD sur ces électrodes a été étudiée par électrochimie. La réaction enzymatique de réduction de O2 implique une consommation de protons couplée à la réaction de transfert d'électrons. En utilisant une analyse in situ, les variations locales de pH qui se produisent à proximité de la bioélectrode pendant la catalyse enzymatique sont visualisées grâce à un fluorophore dont l’émission dépend du pH, la fluorescéine. Nous avons montré que l'intensité de la fluorescence enregistrée est directement proportionnelle aux valeurs du courant catalytique. L'influence de la force ionique sur la catalyse enzymatique a ensuite été spécifiquement explorée. L'électroactivité et l'activité spécifique de l'enzyme ont d’abord été sondées en utilisant respectivement l'électrochimie et la spectroscopie UV-vis. Ensuite, les profils d'appauvrissement en protons à l’interface électrochimique dans des électrolytes tamponnés et non tamponnés ont été reconstruits, afin de déterminer l'influence de la force ionique sur l'environnement local des enzymes. Enfin, les enzymes ont été marquées avec des fluorophores (colorants Alexa Fluor 430 et 647), permettant de révéler les hétérogénéités locales de la distribution des enzymes à la surface de l'électrode.

Thesis resume

Amid the global energy crisis, enzymatic biofuel cells, which utilise biocatalysts (enzymes) to convert chemical energy to electricity, are presenting to be one of the most promising alternative and clean energy resources. This involves the immobilization of redox enzymes on an electrode. Nevertheless, achieving efficient enzyme electrochemistry still raises many challenges. We can obtain the kinetic and thermodynamic information regarding the enzymatic reaction using electrochemical methods. However, an electrochemical measurement is a summation of currents over the entire electrode surface, giving us only global information. This brings the need of coupling electrochemistry to microscopy techniques to explore the spatially resolved information in situ. In this case, fluorescence confocal microscopy coupled with electrochemistry allows to probe the local heterogeneities as well as the diffusion layer of the enzymatic electrode during catalysis. In this thesis, the coupling of confocal laser scanning fluorescence microscopy with electrochemistry has been demonstrated for the characterization of electro-enzymatic catalysis. The main reaction investigated was oxygen reduction reaction catalysed by the enzyme bilirubin oxidase from Myrothecium verrucaria (MvBOD). Graphite and gold (micro)electrodes were fabricated especially for the electrochemical-microscopy setup. The adsorption behaviour of MvBOD on these electrodes was investigated by electrochemistry. The enzymatic O2-reduction involves proton consumption coupled with the electron transfer reaction. Using the in-situ analysis method, local pH variations occurring at the vicinity of the bioelectrode throughout enzymatic catalysis are visualised via a pH-dependent fluorophore, fluorescein. We have shown that the fluorescence intensity recorded is directly proportional to the catalytic current values. The influence of ionic strength on enzymatic catalysis has then been specifically explored. The influence of ionic strength on enzyme electroactivity and enzyme specific activity were probed using electrochemistry and UV-vis spectroscopy, respectively. Then, proton depletion profiles at the electrochemical interface in buffered and unbuffered electrolytes were reconstructed, in order to determine the influence of ionic strength on the local environment of enzymes. Finally, the enzymes have been labelled with fluorescent dyes (Alexa Fluor dyes 430 and 647), making it possible to reveal the local heterogeneities of the enzyme distribution at the electrode surface.