Soutenance de thèse de Estelle MENU

Les infections fongiques systémiques (IFS) sont un problème de santé publique car elles concernent des patients à risques en constante augmentation et leur incidence a augmenté ces dernières années. Ces infections opportunistes sont majoritairement dues à Candida sp. et à Aspergillus sp., et plus rarement aux mucorales, Fusarium sp. ou Scedosporium sp.. Certains champignons, comme Trichosporon sp. ou Saprochaete sp., ont émergés comme agents d’épidémies nosocomiales. La performance du diagnostic biologique des IFS reste insuffisante. Le développement des méthodes basées sur la détection d’acides nucléiques, n’ont pas supplanté la culture mycologique qui reste le « gold standard » du diagnostic des IFS. La difficulté d’extraire efficacement l’ADN fongique est une des principales limites à dépasser. D’autres outils diagnostiques basés sur la détection de biomarqueurs spécifiques des champignons, comme l’antigène galactomannane pour le diagnostic de l’aspergillose invasive, ont des performances sub-optimales, dépendant des populations de patients, des maladies sous-jacentes, de l’utilisation de prophylaxie antifongique et de l’agent pathogènes en cause. Il en résulte une létalité à 3 mois des IFI d’environ 40% en France. Le diagnostic précoce est un axe majeur de progrès, dans le but d’améliorer la prise en charge des patients et réduire la létalité. Dans la première partie, nous avons réalisé un répertoire des champignons filamenteux isolés chez l’Homme. Une revue méthodique et exhaustive de la littérature nous a permis d’inventorier 565 espèces de champignons filamenteux d’intérêt clinique et de décrire les sites anatomiques et le cadre nosologique de ces infections. Une meilleure interprétation des résultats d’identification de ces champignons au laboratoire, basée sur les données de ce répertoire, participera à améliorer la prise en charge des patients concernés. La seconde partie de notre travail visait à optimiser le diagnostic des infections fongiques invasives à levure. Pour cela, nous avons d’abord sélectionné les techniques les plus performantes pour extraire l’ADN des cinq principales espèces de levures d’intérêt clinque : Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis et C. krusei. Après avoir comparé 11 techniques d’extraction d’ADN, nous en avons retenu trois dont la performance était adéquate : NucliSENSTM EasyMAGTM (BioMérieux), EZ1TM DNA Blood 200 µL Kit avec prétraitement (Qiagen), et EZ1TM DNA Tissue Kit avec prétraitement (Qiagen). Ensuite, nous avons cherché à améliorer la détection des levures à partir d’échantillon liquide par une méthode de capture des Candida sp. en solution au moyen de billes magnétiques couplées à des anticorps spécifiques suivi par une détection moléculaire ou antigénique. Ces travaux étant toujours en cours, seuls les résultats préliminaires seront présentés. Enfin, nous nous sommes intéressés au diagnostic des infections invasives à levures rares, pour lesquelles les outils diagnostiques spécifiques sont inexistants. Nous avons ainsi appliqué au diagnostic et suivi des trichosporonoses invasives le dosage d’antigène de Cryptococcus neoformans après avoir décrit une réaction croisée avec Trichosporon japonicum. La dernière partie s’intéresse à l’identification des sources potentielles des infections fongiques invasives. Les micromycètes pouvant être responsables d’épidémies nosocomiales, il est important de connaitre leurs réservoirs et modes de transmission. Nous avons ainsi investigué une épidémie d’infection à Saprochaete clavata dans un centre de cancérologie. Le typage des isolats cliniques et environnementaux nous a permis d’identifier pour la première fois les lave-vaisselles comme réservoir et la vaisselle, contaminée pendant le lavage, comme vecteurs passif de ces champignons.

Invasive fungal infections (IFI) are a public-health issue because they concern patients at risk, which is constantly increasing and their incidence has risen in recent years. These opportunistic infections are predominantly caused by Candida sp. and Aspergillus sp., and more rarely to mucorales, Fusarium sp. or Scedosporium sp.. Some fungi, such as Trichosporon sp. or Saprochaete sp., have emerged as agents of nosocomial epidemics. The performance of biological diagnosis of IFI remains insufficient. The development of methods based on the detection of nucleic acids has not supplanted mycological culture, which remains the "gold standard" of IFI diagnosis. The difficulty of extracting fungal DNA efficiently is one of the main limitations to overcome. Other diagnostic tools based on the detection of fungal-specific biomarkers, such as galactomannan antigen for the diagnosis of invasive aspergillosis, have suboptimal performance, depending on patient populations, underlying diseases, use of antifungal prophylaxis, and the pathogen involved. As a result, the overall 3-month IFIs fatality rate is about 40% in France. Early diagnosis is a major improvement target that would allow enhance the patients’ management and curb this fatality risk. In the first part, we listed all filamentous fungi of clinical interest. After a systematic and comprehensive review of the literature allowed us to inventory 565 species of filamentous fungi of clinical interest and to describe the anatomical sites and nosological entities associated with these fungi. A better interpretation of the results of identification of these fungi in the laboratory, based on the data of this inventory, will contribute to improve the management of the patients concerned. The second part of our work aimed at optimizing the diagnosis of invasive fungal yeast infections. Therefore, we first selected the most efficient techniques to extract DNA from the five main yeast species of clinical interest: Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis and C. krusei. After comparing 11 DNA extraction techniques, we selected three which exhibited adequate performances: NucliSENSTM EasyMAGTM (BioMérieux), EZ1TM DNA Blood 200 µL Kit with pretreatment (Qiagen), and EZ1TM DNA Tissue Kit with pretreatment (Qiagen). Next, we aimed to improve the detection of yeasts from liquid suspensions by capturing Candida sp. in solution using magnetic beads coupled to specific antibodies followed by molecular or antigenic detection. As this work is still in progress, only preliminary results will be presented. Finally, we are interested in the diagnosis of rare invasive yeast infections, for which specific diagnostic tools are inexistent. We have applied the Cryptococcus neoformans antigen assay to the diagnosis and follow-up of invasive trichosporonosis after having described a cross-reaction with Trichosporon japonicum. The last part focuses on identifying potential sources of invasive fungal infections. Micromycetes can be responsible for nosocomial epidemics, so it is important to know their reservoirs and modes of transmission. We have investigated a Saprochaete clavata infection outbreak in a cancer center. We typed both clinical and environmental isolates and identified for the first time dishwashers as the reservoir, and dishes, which were contaminated during washing, as passive vectors of these fungi.