Soutenance de thèse de Julie HARDY

La digestion anaérobie (DA) est un procédé de dégradation de la matière organique en absence d’oxygène qui conduit à la valorisation énergétique des résidus organiques sous forme de biogaz riche en méthane. L’optimisation de ces procédés nécessite une meilleure connaissance du fonctionnement des communautés complexes et de leur réponse fonctionnelle face à des perturbations. Un des principaux objectifs de cette thèse était la construction et la validation d’un pipeline bioinformatique dédié à l’analyse comparative de métatranscriptomes provenant de digesteurs anaérobies soumis à des perturbations. Les approches méta-omiques basées sur le séquençage haut débit, produisent de grandes quantités de données, mettant leur traitement au défi. Un pipeline efficace pour analyser les fonctions des communautés microbiennes actives a été développé durant cette thèse. Le pipeline est conçu pour contrôler la qualité des séquences, éliminer l'ARNr, réaliser une annotation fonctionnelle des lectures en fonction de bases de données fonctionnelles et traiter l'analyse différentielle de l'expression génique. Son efficacité a été validée par l'analyse de données provenant (i) de communautés synthétiques, (ii) d'une étude métatranscriptomique précédente et (iii) de 7 échantillons en triplicats issus un méthaniseur expérimental continu (CSTR) dans lequel nous avons simulé différents épisodes de stress. Pour éprouver le pipeline développé dans cette thèse, nous avons choisi d’étudier l’impact d’apports en ammonium sur le microbiome de la DA. En effet, pendant la digestion anaérobie (DA) des eaux usées riches en protéines, l'ammonium est libéré par la dégradation des acides aminés. Les concentrations élevées en ammonium sont bien connues pour perturber l'équilibre du microbiome de la DA, et entraînent une dégradation de l’activité méthanogénique. Dans une étude préliminaire, nous avons appliqué des apports d’ammonium de concentration croissante (de 1,7 à 15,2 g N-NH4+ L-1) dans des systèmes réactionnels clos constitués d’eaux usées synthétiques, selon deux stratégies : (i) apports indépendants, et (ii) apports successifs. Les performances fonctionnelles, ainsi que la composition des communautés de microorganismes présents et transcriptionnellement actifs ont été analysées par séquençage d’amplicons d’ARNr 16S. Quelle que soit la stratégie d’ajout, la communauté active d’archées méthanogènes initialement enrichie en Methanosaeta subit des changements pour être ensuite enrichie par Methanosarcina et finalement par Methanoculleus au cours de l’augmentation de la teneur en NH4+. Une succession dynamique de bactéries productrices de précurseurs du CH4 (H2 et acides gras volatiles, AGV) et de bactéries oxydant syntrophiquement les AGVs a également été observée, très différente entre les deux stratégies d’ajout d’ammonium. A partir de ces données de métabarcoding nous pouvons émettre l’hypothèse d’un changement potentiel de métabolisme depuis une méthanogénèse réalisée par la voie acétoclaste vers l’oxydation syntrophique de l’acétate couplée à la méthanogénèse hydrogénotrophe lorsque la teneur en ammonium augmente. Pour valider le pipeline métatranscriptomique et vérifier ces hypothèses, différentes perturbations opératoires, dont des apports croissants d’ammonium (entre 3,95 et 5,71 g/L), ont été appliquées à 2 CSTR produisant du CH4. Les performances du processus ont été évaluées par le suivi de la DCO (demande chimique en oxygène), du CH4 et des AGV pendant les 300 jours d'expérimentation. La structure de la communauté microbienne et sa réponse fonctionnelle ont été évaluées régulièrement, par métabarcoding et métatranscriptomique. Nous avons appliqué notre pipeline pour étudier les métatranscriptomes. L'analyse métabarcoding et métatranscriptomique suggère que le système anaérobie répond au stress en ammonium en reconstruisant les associations syntrophiques entre les méthanogènes acétoclastes et hydrogénotrophes et les oxydants d'acétate.

Anaerobic digestion (AD) is a degradation process of organic matter in absence of oxygen that leads to energetic recovery of organic residues in the form of methane-rich biogas. The optimisation of these processes requires a better understanding of the functioning of complex communities and their functional response to disturbances. One of the main objectives of this PhD was the construction and validation of a bioinformatics pipeline dedicated to the comparative analysis of metatranscriptomes from anaerobic digesters subjected to perturbations. Meta-omics approaches based on high-throughput sequencing produce large amounts of data, challenging their processing. An efficient pipeline to analyse the functions of active microbial communities was developed during this thesis. The pipeline is designed to control sequence quality, remove rRNA, perform functional annotation of reads against functional databases and handle differential gene expression analysis. Its efficiency was validated by analysing data from (i) synthetic communities, (ii) a previous metatranscriptomic study and (iii) 7 triplicate samples from a continuous experimental methaniser (CSTR) in which we simulated several stress events. To test the pipeline developed in this PhD, we chose to study the impact of ammonium inputs on the AD microbiome. Indeed, during anaerobic digestion (AD) of protein-rich wastewater, ammonium is released by the degradation of amino acids. High ammonium concentrations are well known to disturb the balance of the AD microbiome, leading to a degradation of the methanogenic activity. In a preliminary study, we applied ammonium inputs of increasing concentration (from 1.7 to 15.2 g N-NH4+ L-1) in closed reaction systems consisting of synthetic wastewater, using two strategies: (i) independent inputs, and (ii) successive inputs. The functional performance and community composition of the microorganisms present and transcriptionally active were analysed by sequencing of 16S rRNA amplicons. Regardless of the addition strategy, the active community of methanogenic archaea initially enriched in Methanosaeta undergoes changes to be enriched in Methanosarcina and finally in Methanoculleus during the increase in NH4+ content. A dynamic succession of bacteria producing CH4 precursors (H2 and volatile fatty acids, VFAs) and bacteria syntrophically oxidising VFAs was also observed, which was markedly different between the two ammonium addition strategies. From these metabarcoding data we can hypothesize a potential shift in metabolism from methanogenesis performed by the acetoclast pathway to syntrophic acetate oxidation coupled with hydrogenotrophic methanogenesis when ammonium content increases. To validate the metatranscriptomic pipeline and to test these hypothesis, different operational perturbations, including increasing ammonium inputs (between 3.95 and 5.71 g/L), were applied to 2 CH4-producing RTSCs. The process performance was evaluated by monitoring COD (chemical oxygen demand), CH4 and VFA during the 300 days of experimentation. The microbial community structure and functional response was regularly assessed by metabarcoding and metatranscriptomics. We applied our pipeline to study metatranscriptomes. Metabarcoding and metatranscriptomic analysis suggests that the anaerobic system responds to ammonium stress by reconstructing syntrophic associations between acetoclast and hydrogenotrophic methanogens and acetate oxidants.