Ecole Doctorale

Sciences de la Vie et de la Santé

Spécialité

Biologie-Santé - Spécialité Microbiologie

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

les champignons marins,oxydases,biotechnologie,

Keywords

biotechnology,oxidases,marine fungi,

Titre de thèse

Criblage de la diversité fongique marine visant à identifier de nouvelles oxydases pour les biotechnologies et le développement durable.
Screening of marine fungal diversity to identify new oxidases for biotechnology and sustainable development.

Date

Wednesday 27 January 2021

Adresse

INRAe, université de Aix-Marseille, 163 avenue de Luminy, Marseille-France salle de soutenance de thèse à l'INRAe

Jury

Directeur de these M. Eric RECORD INRAe-université de Aix-Marseille
Rapporteur M. Ali Faouzi GARGOURI Centre de biotechnologie à Sfax-Tunisie
Rapporteur Mme Harivony RAKOTOARIVONINA Université de Reims Champagne Ardenne
Examinateur Mme Radhia GARGOURI-BOUZID Ecole Nationale d'ingénieurs de Sfax
CoDirecteur de these M. Tahar MECHICHI Ecole Nationale d'ingénieurs de Sfax
Examinateur M. Pedro COUTINHO INRAe-université de Aix-Marseille

Résumé de la thèse

Criblage de la diversité fongique marine visant à identifier de nouvelles oxydases pour les biotechnologies et le développement durable Au cours de ces dernières années, la majorité des champignons étudiés est issue en général du milieu terrestre. Cependant, la diversité fongique marine est très peu étudiée. Vue que les enzymes générés par les champignons marins sont mieux adaptés à la salinité, la haute pression, la basse température, les conditions oligotrophes et les pH extrêmes que les enzymes issus des champignons terrestres, il est essentiel de chercher de nouvelles enzymes provenant d’une souche fongique lignolytique marine capable de dégrader des polluants, pour des intérêts scientifiques et industriels. Lors de cette étude, nous nous sommes intéressés à trois sujets centrés autour de l'exploitation et le développement de nouvelles enzymes de type laccases issues des souches fongiques marines, pour la dégradation de la lignocellulose et l’utilisation industrielle. D’abord, un isolement des champignons ligninolytiques marins a été effectué à partir de trois zones côtières en Tunisie. Les cultures des échantillons prélevés ont permis l’isolement d’une vingtaine d’isolats ligninolytiques dont cinq ont montré une activité potentielle de type laccase, ensuite l’identification moléculaire et morphologique de ces cinq souches sélectionnées montre qu’il s’agit de trois souches de Trichoderma asperellum (T. asperellum1, 2 and 3), une souche Aspergillus nidulans, et une souche de Stemphylium lucomagnoense. Bien que, la souche S. lucomagnoense a montré une meilleure résistance à la présence de sel dans la première partie de cette étude, nous nous sommes intéressés à la souche T. asperellum1 qui a montré une meilleure activité de type laccase. Nous avons effectué une caractérisation partielle de l’enzyme de type laccase secrétée par la souche T.asperellum 1 et nous avons aussi testé son efficacité à décolorer différents types des colorants synthétiques (azoique, anthraquinone, mélange des colorants) en présence et en absence d’un médiateur d’oxydo-réduction, le 1-hydroxybenzotriazole HBT (1mM). Les suites des travaux ont porté sur l'étude des processus de dégradation de la biomasse lignocellulosique des cinq champignons marins isolés, en mesurant leurs activités lignocellulolytiques (xyalanase, cellulase, laccase) dans les conditions salines. S. lucomagnoense qui a présenté la meilleure réponse vis à vis à la présence de sel en termes d'activités enzymatiques a été sélectionné comme modèle pour étudier l’adaptation physiologique au substrat lignocellulosique et à son environnement marin par des approches transcriptomiques et protéomiques. Suite aux résultats obtenus nous avons réussi à faire une expression hétérologue dans une souche d’Aspergillus niger, d’un gène (SlLac2) codant pour une oxydase choisie parmi les 7 gènes putatifs codant pour des laccases complètes du génome de la souche sélectionné S. lucomagnoense. Enfin nous avons purifié et étudié les caractéristiques physico-chimiques et cinétiques de cette enzyme afin de comparer ces caractéristiques avec celles disponibles dans la littérature qui sont issues de laccases de champignons terrestres ou marins.

Thesis resume

Screening of marine fungal diversity in order to identify new oxidases for biotechnologies and sustainable development In recent years, the majority of the fungi studied are generally derived from the terrestrial environment. However, marine fungal diversity is rarely studied. Since enzymes generated by marine fungi are better adapted to salinity, high pressure, low temperature, oligotrophic conditions and extreme pH, compared to enzymes from terrestrial fungi, it is essential to search for new enzymes from a marine lignolytic fungal strain capable of degrading pollutants, for scientific and industrial interests. During this study, we were interested in three topics centered around the exploitation and development of new laccase type enzymes from marine fungal strains for lignocellulose degradation and industrial use. First, an isolation of marine ligninolytic fungi was carried out from three coastal areas in Tunisia. The cultures of the samples taken allowed the isolation of the twenty ligninolytic isolates of which five showed a potential laccase-like activity. Then the molecular and morphological identification of these five selected strains shows that they are three strains of Trichoderma asperellum (T. asperellum1, 2 and 3), one strain of Aspergillus nidulans, and one strain of Stemphylium lucomagnoense. Although, the S. lucomagnoense strain showed better resistance to the presence of salt in the first part of this study, we were interested in the T. asperellum1 strain which showed better laccase-like activity. We performed a partial characterization of the laccase-type enzyme secreted by the T. asperellum 1 strain and we also tested its efficiency to decolorize different types of synthetic dyes (azo, anthraquinone, mixture of dyes) in the presence and absence of a redox mediator, 1-hydroxybenzotriazole HBT (1mM). The continuation of the work focused on the study of the degradation processes of the lignocellulosic biomass of the five isolated marine fungi, by measuring their lignocellulolytic activities (xyalanase, cellulase, oxidase) under saline conditions. S. lucomagnoense, which showed the best response to the presence of salt in terms of enzymatic activities, was selected as a model to study the physiological adaptation to the lignocellulosic substrate and its marine environment using transcriptomic and proteomic approaches. Following the results obtained we have succeeded in making a heterologous expression in an Aspergillus niger strain of a gene (SlLac2) coding for an oxidase, selected among the 7 putative genes that are coding for complete laccases in the genome of the selected strain S. lucomagnoense. Finally, we have purified and studied the physico-chemical and kinetic characteristics of this enzyme in order to compare these characteristics with those available in the literature which are derived from terrestrial or marine fungal laccases.